Молекулярная биология

Отдел доктора Азеа изучает активность hsp с целью разработки эффективных иммунотерапевтических подходов с использованием этих белков. Эта группа впервые обнаружила, что экзогенный hsp70 обладает высокой цитокиновой активностью Ученые установили, что широко используемые адаптогены могут оказывать влияние на плазменный уровень hsp. Экстракты элеутерококка, родиолы розовой и лимонника китайского при постоянном приеме (опыты проводились на мышах) приводят к возрастанию плазменного уровня hsp72. Таким образом, прием адаптогенов воспринимается организмом как своеобразный стресс, при этом повышается устойчивость организма к реально озникающим стрессовым ситуациям. Также ими была оценена роль hsp в долголетии. Они предположили, что уровень hsp70 у долгожителей и их потомков должны отличаться от таковых у контрольных индивидов.

Один из видов гистоновых диацетилаз — сиртуин SIRT1 вовлечен в многочисленные биологические процессы, имеющие и положительное и отрицательное значение. Сиртуины были открыты в связи с их значением для увеличения продолжительности жизни (в культуре дрожжей). Наиболее исследованный представитель этого семейства SIRT1 участвует во множестве процессов, включая апоптоз, старение, гомеостаз липидов и глюкозы, секрецию инсулина и аксональную деградацию. Было выяснено также, что SIRT1, по-видимому, играет критическую роль в процессе возникновения некоторых опухолей, особенно в возникновении возрастных неоплазм. В работах американских ученых исследуются взаимодействия сиртуина SIRT1 и мелатонина в поддержании циркадных ритмов, и их значение в процессах старения и образования рака. Изменения в циркадных ритмах и продукции эпифизом гормона мелатонина связаны с риском возникновения рака и старением. Прием мелатонина может способствовать ингибированию сиртуина SIRT1, что может быть причиной антиракового эффекта мелатонина.

Уильям Эндрюс был одним из первооткрывателей одновременно РНК и белкового компонентов в теломеразе человека, и был удостоен за эту работу Национальной премии за лучшую инновацию. Сейчас он сфокусирован на исследованиях, направленных на индуцирование экспрессии генов, задействованных в работе теломеразы.Под его руководством проводится скрининг веществ, которые способны активировать ген, препятствующий укорочению теломер в соматических клетках человека. Несколько лет назад Эндрюс и его коллеги внедрили ген теломеразы в клетки кожи человека, у которых были очень короткие теломеры. За-тем эти клетки имплантировали для выращивания в кожу на спине мыши. Кожа, сформированная из клеток без гена теломеразы, выгладела старой, морщинистой, хрупкой. Кожа, выращенная из клеток, в которые был внедрен ген теломеразы, выглядела молодой. Показатели уровня экспресии генов соответствовали молодому возрасту. В ноябре 2008 года была опубликована работа, в которой описывался процесс создания клонированной мыши из клеток, содержащих внедренный ген теломеразы и продуцирующих фермент теломеразы. Было показано, что эти мыши жили дольше на 50%, по сравнению с клонированными мышами, созданными из клеток, не содержащих этот ген. Тогда стало ясно, что предотвращение укорочения теломер, возможно, лучший путь для создания антивозрастной терапии.Внедрение гена напрямую в ДНК, используя вирусные векторы, – не очень жизнеспособная идея, поскольку это может вызвать рак. Однако ген теломеразы уже существует во всех наших клетках, поскольку ДНК всех клеток идентична – мышцы, кожа, печень содержат одну и ту же генетическую информацию. Причина, почему соматические клетки, в отличие от репродуктивных, не продуцируют теломеразу, в том, что у них этот ген подавлен. Есть один или два участка ДНК, соседствующих с геном теломеразы, которые связывают продуцируемый ими белок, и если это происходит, то клетки не могут создавать теломеразу. Подобные вещества недавно были открыты. Один из них ТА-65 – в Кор-порации Герон и на данный момент лицензирован Sierra Sciences. Эта компания, используя роботизиро-ванный высокоскоростной метод сканирования веществ, обнаружила около 200 веществ в 29 различных группах лекарственных препаратов, которые индуцируют теломеразную активность в нормальных клетках.Но «совершенное» лекарство, под-ходящее человеку, еще не найдено. Ни одно из веществ не индуцируют теломеразу в достаточно больших количествах, чтобы увеличить продолжительность жизни клетки. Некоторые – токсичны (кроме ТА-65).Предполагается продолжить скрининг (примерно 4000 веществ в неделю), провести сравнительные исследования отобранных веществ и на основе этого создать препарат, продлевающий жизнь соматическим клеткам человека. На данный момент отобрано 33 вещества, которые могут стать основой для препарата, блокирующего супрессию «гена теломеразы». Однако подавленный белок можно «выманить», используя маленькие молекулы, которые воздействуют на этот супрессор и не дают ему атаковать ДНК. Если будет найдено подходящее вещество, содержащее эти молекулы, то это, возможно, «включит» теломеразную активность в каждой клетке человеческого тела.

Изменения, происходящие у старых животных с митохондриями, включают существенное уменьшение мембранного потенциала. В мем-бране митохондрий уменьшается уровень кардиолипина — важного фосфолипида, который является кофактором для ряда важных мито-хондриальных транспортных белков, уменьшается количество коэнзима Q10 и карнитина который важен для бета-окисления жирных кислот. В лаборатории возглавляемой профессором Эймсом было показано, что ацетил-карнитин улучшает состояние старых животных непосредственно влияя на митохондрии. Также на состояние митохондрий влияла альфа-липоевая кислота. Как и карнитин она увеличивала мембранный потенциал старых крыс и устраняла часть повреждений, связанных с возрастными изменениями организма у старых животных. И кроме тогопри получении подопытными жи-вотными альфа-липоевой кислоты увеличивалось в митохондриях количество глутатиона и витамина С — естественных антиоксидантов. Изоформа альфа-липоевой кислоты: R-альфа-липоевая кислота — оказывалась эффективней обычной альфа-липоевой кислоты в десять раз. Ацетил-карнитин восстанавливает у старых мы-шей мембранный потенциал до такого же уровня как у молодых животных, облегчает транспорт жирных кислот в митохондрии и увеличивает интенсивность клеточного дыхания. R-альфа-липоевая кислота может быть простым и эффективным путем для улучшение общей метаболической активности и борьбы с повреждениями, наносимыми активными формами кислорода.

Исследовательская группа под руководством Эдуардо изучает вторичные мессенджеры — малые сигнальные молекулы, которые производятся клеткой в ответ на различные физиологические стимулы. Белок CD38 является многофункциональным ферментом, использующим молекулу НАД+ в качестве субстрата для синтеза вторичных мессенджеров, например цАДФ-рибозы. Ин-тересно также то, что белок CD38 присутствует на внутренней ядерной мембране. Под руководством Эдуар-до Чини было проведено исследование опосредованного влияния белка CD38 на ферментативную активность SIRT1, через регуляцию уровня НАД+.Было выявлено, что у мышей с вы-ключенным геном CD38, тканевой уровень НАД+ существенно повышен. Исследователи также обнаружили, что инкубация очищенного рекомбинантного белка SIRT1 с белком CD38 или ядерным экстрактом от мышей дикого типа приводит к инги-бированию активности SIRT1. Более того, эндогенная активность SIRT1 у мышей с «выключенным» CD38 оказалась в несколько раз выше по сравнению с диким типом. Кроме того, у мутантных мышей был повышен уровень деацетилирования одного из субстратов фермента SIRT1 — белка р53. Эти данные подтверждают, что CD38 является основным регулятором соотношения клеточного/ядерного уровня НАД+ и активности SIRT1, и указывают на ещё одну возможную регуляционную точку активности сиртуинов.

Главное направление исследований в лаборатории Сандры Ли Хофман — ковалентная модификация белков липидами. Эта работа привела к открытию нового лизосомального фермента (пальмитоил-белковой тиоэстеразы — PPT, или CLN1), нарушение функционирования которого вызывает нейро-дегенеративное заболевание — детский неврональный цероид-липофусциноз (INCL). РТТ отщепляет длинноцепочечные жирные кислоты от цистеиновых остатков белков, что приводит к повышенной аккумуляции липофусцина. Ученые предположили, что при лечении INCL может быть полезен препарат цистеамин, используемый для терапии цистиноза (наследственной болезни, при которой нарушается транспорт цистина из лизосом, вследствие чего его кристаллы накапливаются в ретикулярных клетках костного мозга, печени, селезёнки и лимфатической системы, а также в клетках роговицы и конъюнктивы). Было проведено сравнение скорости превращения пальмитоил-СоА (субстрата PPT) и цистина при использовании цистеамина. В результате выяснилось, что тиолатный ион проявляет химическую активность в реакции расщепления. Таким образом, необходимы дальнейшие усовершенствования в разработке небольших молекул лекарственных веществ, используемых для лечения INCL. Кроме того, аминогруппа цистеамина, по-видимому, благоприятствует проникновению его молекулы в лизосомы. При этом на накопление субстратов PPT цистеамин влиял незначительно.

Обычный белок плазмы — плазменный компонент амилоида P (SAP) связывается с фибриллами всех типов амилоидных отложений и таким образом участвует в образовании амилоида. Это связано со специфическим кальций-зависимым связыванием с аминокислотными мотивами, которыми обладают все типы амилоидных фибрилл. Таким образом, SAP остается в составе амилоидных отложений в течение длительного времени, не изменяясь. У мышей и хомяков плазменные концентрации SAP напрямую связаны с амилоидогенезом. Филип Хокинс с коллегами предположили, что SAP может отвечать за невозможность удаления амилоидных отложений, приводя, таким образом, к повреждению ткани и развитию заболевания. Это приводит к значительному снижению уровня циркулирующего SAP. Это вещество представляет собой новый подход к лечению как системных, так и локальных амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера и диабет типа 2. SAP очень устойчив к протеолизу, его связывание с амилоидными фибриллами защищает их от разрушения фагоцитами и протеолитическими ферментами. Для вмешательства в этот процесс был разработан препарат, являющийся конкурентным ингибитором связывания SAP с амилоидными фибриллами. Это вещество димеризует молекулы SAP, образуя поперечные сшивки, поэтому они легко выводятся через печень.

Причиной возрастного ухудшения тимопоэза и иммунных функций может быть изменяющийся с возрастом цинковый статус. Добавление цинка в пищу улучшает тимопоэз, что подтверждается увеличением числа тимоцитов. В исследовании, проведенном группой профессора Хо из Универ-ситета Орегона, улучшенная производительность тимуса была связана частично с уменьшением возрастного накопления незрелых CD4(-)CD8(-)CD44(+)CD25(-) тимоцитов, а также с уменьшением экспрессии фактора стволовых клеток — цитокина, подавляющего функции тимуса. В другой своей работе Э. Хо с сотрудниками показали, что самая малая нехватка цинка в рационе мужских особей крыс подвергла ткань простаты повышенному оксидативному стрессу и увеличенному количеству повреждений в ДНК клеток ткани этого органа. У крыс с дефицитом цинка была обнаружена повышенная экспрессия p53 и PARP, что и явилось причиной возникновения ДНК мутаций. Учёные сделали вывод о необходимости потребления необходимой дозы цинка для уменьшения риска заболевания раком простаты.

Основной темой исследования профессора Харриса является приобретенные и врожденные механизмы направленного мутагенеза. Разнообразие антител на генном уровне и ограничение подвижности ретроэлементов — оба эти механизма катализируются ДНК цитозин-дезаминазами. Установлено, что белки семейства дезаминаз могут ингибировать ретротранспозцию мобильных элементов L1, а также вируса ВИЧ с помощью механизма, не связанного с дезаминированием. Этот механизм работает в цитоплазме клеток во время трансляции белков или посттрансляционно. Полученные учеными данные предполагают, что белки семейства дезаминаз являются неотъемлемой частью врожденного иммунитета и играют важную роль в создании многообразия антител. Возможно, что белки этого семейства (такие как APOBEC3) используют ткань-специфичные кофакторы или посттрансляционные модификации для максимально эффективной коррекции рестрикции. Результаты этих исследований помогут глубже понять механизмы «благоприятных» мутаций, разработать терапевтические подходы к управлению ими, и разобраться, как сбой в работе этих механизмов может приводить к неоплазии.

Предполагается, что накопление окисленных белков при старении связано с нарушениями протеасомной деградации. Известно, что облучение ультрафиолетом фибробластов кожи человека запускает в них сигнальный каскад, приводящий к повышенной экспрессии металлопептидазы 1 матрицы (MMP-1), которая вызывает разрушение внеклеточных белков (в том числе, коллагена), приводящее к старению кожи. Группой Фриге было показано, что эти процессы сопровождались накоплением c-Jun и активацией AP-1 — транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию металлопептидазы. Такие же процессы наблюдались при ингибировании протеасом белками, вызывающими формирование поперечных сшивок и лактацистином. Это говорит о том, что механизмы у данных процессов общие. В свою очередь, суперэкспрессия субъединиц протеасом приводила к тому, что в ответ на облучение уровень металлопептидазы не повышался. Ученые группы Фриге исследовали возможность растительных экстрактов препятствовать трансформации белков при облучении, чтобы в пер-спективе использовать препараты на их основе для замедления старения кожи. Исследования показали, что экстракт водоросли Phaeodactylum tricornutum способен активировать протеолити-ческую активность протеасом. Обработка клеток экстрактом водоросли позволила им сохранить уровень активных протеасом при облучении. Более того, уровень окисленных белков при обработке экстрактом и последующим облучением был значительно ниже, чем у необработанных. Требуется дальнейшее изучение возможности регулировки интенсивности старения кожи человека с помощью воздействия на активность протеасом. Известно, что в апоптотических сигнальных каскадах, происходящих при облучении клеток, принимают участие белки, регулирующие активность протеасом. Дальнейшие исследования эффектов экстракта Phaeodactylum tricornutum — перспективное направление в области повышения жизнеспособности кератиноцитов кожи при воздействии солнечной радиации.