Клеточные технологии

В исследованиях доктора Паула-Барбосы сравнивалась эффективность применения красного вина и портвейна, также богатого флавонолами, для снижения уровня липофусцина в клетках головного мозга. К удивлению исследователей, после 6 месяцев добавления в рацион крыс портвейна было обнаружено увеличение содержание липофусцина по сравнению с контролем и животными, получавшими 20% этанол с добавлением флавонолов красного вина. При этом его уровень был таким же, как и у крыс, употреблявших только 20% спирт. Пониженная антиоксидантная активность портвейна может быть связана с видом и количеством содержащихся в нём флавонолов, а также с содержанием в нём сахаров. Известно, что применение флаванолов, входящих в состав красного вина, предотвращает накопление липофусцина в нейронах животных, употребляющих алкоголь.

При инфицировании производных от моноцитов дендритных клеток (moDC) парамиксовирусом Simian Virus 5 (SV5) наблюдается заметный цитопатический эффект и апоптоз. При этом полностью тормозится процесс созревания клеток. Использование толл-подобных рецепторов TLR-4 и TLR-6 уменьшало цитопатические эффекты и апоптоз клеток, но не изменяло уровень вирусных белков в клетке и продукцию вируса. Однако в присутствие ингибитора NFkB созревание клеток и уменьшение уровня апоптотических явлений блокировалось. Это свидетельствует о ключевой роли NFkB-сигнального пути в онтогенезе клетки. Подобные случаи были описаны и для некоторых других вирусов (например, вирус Ласса). Внутриклеточные механизмы, зависимые от NFkB-сигнального пути, могут быть использованы для создания вакцин в случае некоторых вирусных заболеваний. Остановка созревания клеток при вирусной инфекции, в частности Т-клеток, приводит к общему ослаблению иммунного ответа организма. Восстановление антигенной активности уже пораженных вирусом клеток иммунной системы за счет модуляции внутриклеточных сигнальных путей представляют значительный интерес для современной медицины.

Уровень бета-амилоида в мозгу курящих пациентов с болезнью Альцгеймера достоверно ниже, чем у некурящих больных. Аналогичные данные были получены при изучении эффектов никотина на трансгенных мышах с повышенным уровнем предшественника амилоида. Для выяснения механизма, с помощью которого никотин регулирует процессинг предшественника амилоида (АPP), ученые группы Агнеты Норнберг измерили его уровень и уровень бета-амилоида в линиях клеток, экспрессирующих различные подтипы никотиновых рецепторов или не экспрессирующих их. Результаты исследований показали, что для специфических изменений в процессинге APP необходимо связывание вещества с сайтом связывания агонистов, а не активация рецептора. При этом блокатор открытых каналов мекамиламин снимал никотин-зависимое повышение уровня APP. Кроме того, в клетках, не экспрессирующих никотиновые рецепторы, изменения процессинга APP не наблюдалось, что свидетельствует о том, что описанные эффекты опосредованны воздействием на рецептор, а не прямым действием никотина на клетку. Полученные результаты могут быть использованы в разработке новых препаратов, снижающих уровень амилоида, путем воздействия на никотиновые рецепторы ацетилхолина.

Группа под руководством профессора Лилоглу занимается изучением нарушения механизмов метилирования ДНК в раковых клетках человека и возможной роли гипометилирования в процессах ретротранспозиционной нестабильности генома. LINE-1 и Alu — ретротранспозоны без длинных концевых повторов (non-LTR retrotransposons) — активно метилируются в опухолях человека. С помощью пиросеквенирования в лаборатории профессора Лилоглу были изучены уровни метилирования ретротранспозонов LINE-1 и Alu в 48 типах клеток карциномы. Было показано, что в этих клетках значительно снижен уровень метилирования данных последовательностей. Генетическую нестабильность тестировали с помощью флуоресцентных микросателитных маркеров, расположенных на раковых клетках легких. Было установлено, гипометилирование обоих элементов связано с повышенной нестабильностью генома. Таким образом, показана очевидная связь между гипометилированием мобильных элементов и генетической нестабильностью в клетках карциномы. В настоящее время деметилирующие агенты активно проходят клинические испытания, а более глубокое понимание процессов реактивации ретротранспозонов поможет сделать прорыв в лечении рака.

Область научных интересов лаборатории Рональда Кристала — разработка векторов на основе аденоассоциированных вирусов; генная терапия рака и заболеваний центральной нервной системы. Поздний младенческий неврональный цероид-липофусциноз (LINCL) вызывается мутацией в гене CLN2, приводящей к дефициту белка трипептидилпептидазы-I (TPP-I). В работах доктора Кристала было показано, что непосредственное введение в центральную нервную систему взрослых мышей, нокаутных по гену CLN2, вектора AAVrh.10hCLN2 (аденоассоциированного вируса серотипа rh.10, экспрессирующего кДНК CLN2 дикого типа), частично улучшает неврологические функции и повышает продолжительность жизни. Позднее ученые провели эксперименты с целью определения наиболее благоприятного возраста для генной терапии. Вектор вводили непосредственно в центральную нервную систему нокаутных по гену CLN2 мышей трёх возрастных групп (2-дневных, 3-х и 7-недельных). У всех опытных групп заметно увеличилась суммарная активность TPP-I по сравнению с мышами дикого типа. Однако через год после применения вектора гораздо более высокие уровни активности TPP-I в центральной нервной системе показали мыши, обработанные вектором непосредственно после рождения. Медиана смерти у неонатально обработанных мышей составила 376 дней, у обработанных в три недели — 277 дней, у обработанных в 7 недель — 168 дней, у мышей, не подвергавшихся лечению — 121 день. Полученные данные говорят о том, что максимальной эффективности генной терапии детских лизосомальных заболеваний, затрагивающих нервную систему, возможно достичь при раннем выявлении и лечении.

Пауль Коффер идентифицировал киназу белка B (PKB/c-akt) — новое звено во внутриклеточной передаче сигнала. Его исследовательская группа показала, что PKB-зависимое фосфорилирование факторов транскрипции FOXO является критическим для регулирования быстрого увеличения лейкоцитов и выживания. Эти исследования подтвердили роль эволюционно-консервативных транскрипционных путей в поддержании неограниченного срока службы кроветворных стволовых клеток. Совместно с профессором Бургерингом Пауль Коффер показал роль членов семейства факторов FOXO в иммунной системе. По результатам совместных исследований, активация только одного FKHR-L1 может объединить все известные элементы программы апоптоза, обычно вызываемой изъятием цитокина. Таким образом, PI3K/PKB-зависимое запрещение этого фактора транскрипции, вероятно, обеспечивает механизм предотвращения запрограммированной клеточной смерти. Пауль Коффер продолжает исследования регулирования внутриклеточных сигнальных путей и их роли в судьбе стволовой клетки. Результаты этой работы могут помочь в дальнейшей разработке способов лечения детской лейкемии и аутоиммунных болезней.

Области научных интересов профессора Калабриза: изучение роли оксидативного стресса и нарушения функции митохондрий в старении, нейродегенерации и продолжительности жизни, клеточного ответа на стресс, в том числе и клеток мозга, в особенности, регуляция функций белками теплового шока. Недавно было показано, что пищевые антиоксиданты, такие как полифенолы и L-карнитин/ацетил-L-карнитин, обладают нейропротекторным эффектом, так как способны активировать экспрессию витагенов. Профессор Калабриз предлагает использовать известные по этому вопросу данные для проведения клинических исследований и подбора оптимальных доз лекарственных средств для лечения большого числа заболеваний. В его лаборатории также было показано, что активные формы кислорода (АФК), которые, как ранее считалось, крайне вредны, так как служат причиной оксидативного повреждения биологических структур (оксидативного стресса), оказывают также и положительное влияние на организм — в физиологических концентрациях они могут регулировать ключевые процессы метаболизма клетки, например, регулировать экспрессию и активность важных антиокислительных ферментов и транскрипционных факторов, в том числе и hsp. Профессор Калабриз считает, что, большой интерес представляет поиск препаратов, индуцирующих hsp-ответ на стресс, поскольку он обладает огромными цитопротекторными свойствами. В частности, hsp70 и hsp90 возможно использовать в качестве мишеней.

Миметики ограничения калорийности позволяют воздействовать на метаболические пути, не уменьшая количества потребляемых калорий. Под руководством доктора Ингрэма впервые была открыта 2 деокси-глюкоза — первый известный миметик ограничения калорийности. Это вещество увеличивает чувствительность к инсулину и уменьшает уровень глюкозы в крови, являясь ингибитором гликолиза. Однако 2-деокси-глюкоза токсична в высоких дозах, поэтому в качестве миметика ограничения калорийности она широко не применяется. В лаборатории доктора Ингрэма продолжается поиск миметиков ограничения калорийности с целью идентификации компонентов, имитирующих влияние ограничения калорийности питания.

Целью исследования лаборатории Петтери Илмонена было найти ответ на вопрос — является ли инфекция наряду с окислительным стрессом и воспалением фактором укорочения теломер? Ученые экспериментально проверяли, является ли Salmonella enterica причиной укорочения теломер у одомашненных диких мышей. Мышей несколько раз заражали пятью различными штаммами S. enterica в течение несколько месяцев. В контрольной группе были родственные им мыши. Длину теломер определяли в белых кровяных тельцах (БКТ) после заражений с помощью ПЦР в режиме реального времени. Результаты показали, что многократное заражение Salmonella вызывает укорочение теломер в БКТ, особенно у особей мужского пола по сравнению с самками. Также было установлено, что более быстрое укорочение теломер повышало риск смертности, однако эти результаты были статистически незначимы. Таким образом, результаты исследований показали, что инфекция провоцирует укорочение теломер и подтвердили предположение о том, что длина теломер может быть использована как биомаркер для оценки контакта организма с инфекцией и способности справляться с ней.

Научной группой Рудольфа Джениша в 2007 году был проведен эксперимент, схожий с опытом Яманака: на основе фибробластов были получены iPS с помощью ретровирусного введения Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Было доказано, что профиль экспрессии, метилирования и состояние хроматина iPS аналогичны таковым у эмбриональных стволовых клеток. На основе iPS впервые были получены жизнеспособные химеры. В эксперименте были использованы мыши, чьи гены, кодирующие глобины, были заменены на человеческие гены, несущие мутации. У таких мышей развивалась серповидно-клеточная анемия. На основе полученных из больных мышей фибробластов были сделаны iPS, в которые добавляли «здоровые гены». Затем iPS вводили обратно больным мышам, после чего их состояние улучшалось за счет формирования миелоидных клеток из iPS. iPS могут найти применение в области лечения нейродегенеративных заболеваний, что подтверждается экспериментами по лечению болезни Паркинскона на мышиной модели заболевания. iPS, полученные на основе фибробластов с помощью введения Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, вводили в мозг эмбриона мыши. iPS мигрировали в различные участки мозга и дифференцировались в разные типы клеток: глиальные клетки, нейроны, включая глутаматэргические, GABA-эргические и катехоламинэргические. Морфологический анализ и электрофизиологические исследования подтвердили, что привитые клетки полностью интегрировались в мозг. Удалось добиться улучшения состояния мыши с болезнь Паркинсона, которой были трансплантированы iPS, дифференцированные в допаминэргические нейроны. Об экспериментах на людях еще говорить рано, однако, перспективы использования iPS многообещающи: из фибробластов больных идиопатической формой болезни Паркинсона были получены допаминэргические нейроны. В 2008 году была разработана более эффективная и безопасная с точки зрения развития опухолей система получения iPS. Было предложено инфицировать фибробласты лентивирусами, несущими dox-индуцируемые факторы перепрограммирования. Эффективность такой системы оказалась в 25–50 раз выше, чем у ранее предложенной методики. На примере мышиной модели серповидно-клеточной анемии была впервые продемонстрирована возможность лечения генетических дефектов c помощью iPS. В будущем, возможно, удастся обойтись без доставки генов в соматические клетки для перепрограммирования. В частности, в результате скрининга различных химических соединений, было найдено вещество, аналогичное по воздействию Klf4.