Молекулярная биология

В лаборатории Йошиуки Сакаки был изучен эффект метилирования на транскрипцию элемента L1 in vivo и in vitro. Трансфекция клеток линии плазмидой, содержащей вставку промотора L1, показала, чтометилирование действительно репрессировало активность мобильного элемента L1. Изучение процессов транскрипции in vitroс использованием матриц, подвергнутых мутагенезу, выявило, что метилирование первых семи нуклеотидов CpGs в L1 промоторе, было критичным для ингибирования. Таким образом, сайт-специфичное метилирование способно регулировать транскрипцию L1.

У молодых или взрослых организмов ниши стволовых клеток эффективно замещают утраченные клетки: стволовые клетки выходят из ниш, делятся и дифференцируют. В пожилом возрасте стволовые клетки имеют низкие уровни теломеразы, недостаточные для сохранения стабильности теломер. Поэтому стволовые клетки в старости имеют укороченные теломеры и пониженную мобилизационную активность для эффективной регенерации тканей. Вместе с тем они ускоряют старение из-за низкой мобилизационной активности стволовых клеток и прогрессирующей дегенерации тканей. Стволовые клетки с аномально высокими уровнями теломеразы (это может произойти, например, в результате мутации) мобилизуются более быстро, чем нормальные клетки. В таких условиях обновление ткани происходит быстро, но повышается риск развития рака. В исследованиях профессора Рудольфа используется мышь, дефектная по теломеразе, в качестве модельной системы изучения процесса укорочения и сохранения стабильности хромосом в стволовых клетках. Укорочение теломер значительно сокращает пролиферативный потенциал стволовых клеток взрослого организма. Установлено, что укорочение теломер индуцирует в клетке механизм внутреннего контроля и остановку клеточного цикла (intrinsic checkpoint) , снижающего самообновление и функцию взрослых стволовых клеток. Ингибирование этого механизма (например, делеция локуса Cdkn1/p15INK4b — циклин-зависимого ингибитора киназ, инактивация экзонуклеазы-1) восстанавливало функцию стволовых клеток и продляло жизнь мышей с отсутствием теломеразы. Кроме того, укорочение теломер способствует патологическим изменениям в окружении ниши стволовых клеток и развитию болезней стволовых клеток (гемопоэтическая дисфункция и проч). В Ганновере проф. Рудольф проводил исследования по влиянию укорочения хромосом на регенеративную функцию печени и обнаружил, что укорочение хромосом в гепатоцитах связано с хромосомной нестабильностью и повышенным риском развития рака печени и цирроза печени. Короткие теломеры стволовых клеток препятствуют накоплению ненормальных и модифицированных клеток в здоровой ткани, тем самым снижая онкогенный риск.

Основные темы исследований лаборатории Томаса Рандо — старение стволовых клеток (сателлитных клеток) в мышце, влияние ниш стволовых клеток на этот процесс, возможность «омоложения» взрослых прогениторных клеток. Используя мышей в качестве моделей для исследования регенеративной способности мышечной ткани, исследователи группы Томаса Рандо выяснили, что с возрастом происходит уменьшение активации Notch (трансмембранные белки), результатом чего является ухудшение регенеративного потенциала сателлитных клеток. При повреждении «юных» мышц усиливается секреция трансмембранного лиганда Notch — Delta, инициируя, тем самым, Notch-сигнальный каскад в стволовых клетках, что приводит к их усиленной пролиферации. Воздействие сыворотки от моло-дой особи на сателлитные клетки старой особи in vitro также приводило к усиленной экспрессии Delta, большей активации Notch и выросшей пролиферацией этих клеток in vitro. Ещё одним важным результатом исследований стало доказательство того факта, что Wnt — сигнальная активность в активированных сателлитных клетках у старых мышей значительно выше, чем у молодых. Аналогично, при обработке сателлитных клеток «старой» сывороткой, активность Wnt возрастала. Поскольку Wnt играют существенную роль в фиброзе, то можно сделать вывод, что активация Wnt в этом случае означает, что сателлитные клетки старого организма активируются для образования фибрина, что ведет к дальнейшему фиброзу в регенерации мышцы. Таким образом, ингибирование Wnt- сигнального пути позволяет остановить дифференцировку стволовых клеток мышечного волокна в фиброзную ткань. Важные выводы, которые можно сделать из этих исследований:1. Соматические факторы могут моделировать молекулярные сигнальные пути, активирующие тканеспецифичные прогениторные клетки. 2. Микрооркужение (ниши) стволовых клеток у молодых животных стимулирует регенерацию, в то время как у взрослых особей либо не способно стимулировать, либо подавляет регенерацию тканей.3. Уменьшение регенеративной способности ткани с возрастом может быть обратимо при использовании определенных факторов. Ингибирование Notch у молодых мышей ухудшало регене-рацию их мышечного волокна, в то время как его направ-ленная активация возвращала в прежнее состояние реге-неративную способность волокон у более старой особи.

В лаборатории доктора Равкана на модели C. Elegans был идентифицирован целый ряд генов, положительно или отрицательно регулирующих пути и-РНК и micro-РНК. Выяснилось, что C. Elegans, подобно млекопитающим, для управления метаболизмом и долговечностью использует сигнальный путь инсулина. Лаборатория доктора Равкана рассмотрела 18 000 генов и их действие в регулировании долговечности, отложения жира, и-РНК и линьки C. Elegans. Стало ясно, что передача сигналов инсулина является самой мощной инактивацией гена, которая может увеличить продолжительность жизни C. Elegans. Текущее исследования в лаборатории Гэри Равкана направлены на объединение списков генов, регулирующих старение, в механизмы, которые оценивают и регулируют темп и вид метаболизма, регенерацию, защитные и дегенеративные механизмы. Эти списки генов иллюстрируют многие шаги в регулировании энергии, включая метаболические ферменты, которые хранят и мобилизуют жир, гормональные сигналы от жирных отложений до центров насыщения в мозге. У червя C. elegans жировой обмен регулируется 400 генами. 200 из этих генов имеют гомологи у человека. Поэтому в результате исследований, проводимых на C. Elegans, могут быть разработаны препараты для лечения людей от ожирения. Гены пути инсулина, которые были выявлены в результате исследова-ний, представляют новые цели для разработки в будущем препаратов от диабета. Эти исследования помогут понять нейроэндокринологию энергетического баланса и долгожительства.

Лаборатория Питера Рабиновича ведет исследования неопластических процессов, которые сосредоточены на предраковом состоянии при язвенном колите, с целью поиска биомаркеров развития опухоли. Неспецифический язвенный колит — это хроническое воспалительное заболевание толстого отдела кишеч-ника, ассоциированное с высоким риском развития колоректальной карциномы вследствие генетической нестабильности клеток. Ученые группы Питера Рабиновича предположили, чтобыстрое обновление клеток и окислительный стресс при язвенном колите могут приводить к ускоренному укорочению теломер и, в конечном счете, к хромосомным нарушениям и раку. Хромосомные аберрации и теломеры изучали у пациентов с язвенным колитом с дисплазией или без или в стадии рака с помощью гибридизации in situ. При биопсии теломеры пациентов с дисплазией были короче, чем у пациентов без дисплазии. Таким образом, результаты исследования показывают взаимосвязь длины теломер и хромосомной нестабильности в предраковом состоянии.

В лаборатории Мэтью Протеуса разработаны нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), способные создавать специфические двуцепочечные разрывы в ДНК клеток млекопитающих, которые в значительной степени стимулируют процесс гомологической рекомбинации. Особенность нуклеаз ZFN заключается в возможности модификации цинко-пальчатых доменов для связывания с различными последовательностями ДНК. В рамках разработки новой технологии были получены ZFNs для прицельной замены последовательности в гене GFP и гене CD8a человека. При сотрудничестве с Sangamo Biosciences (Richmond, CA), синтезирована нуклеаза, мишенью которой является экзон 5- рецептора интрелейкина общей γ-цепи. В гематопоэтических клетках такие нуклеазы вносят двуцепочечные разрывы с частотой 5–18%. Также в сотрудничестве с Sangamo сейчас разрабатывается нуклеаза, мишенью которой является локус β-глобина человека. Нуклеаза ZFN отличается от нуклеазы I-SceI своей цитотоксичностью при экспресиии в клетках млекопитающих. Она, возможно, обусловлена рестрикционной активностью вне сайта узнавания. Поэтому основные усилия направлены на преодоление цитотоксичности нуклеаз ZFN, что может быть достигнуто двумя путями — выявлением возможных сайтов — «немишеней» и их использования для вставки чужеродной ДНК, а также повышение специфичности и уровня экспрессии этих нуклеаз в клетке. Для повышения частоты направленной гомологической рекомбинации возможно применять аденосателлиты совместно с нуклеазами, которые могут повышать частоту рекомбинации в 100 раз. Теоретически возможно создание ZFN для направленной гомологиче-ской рекомбинации в любом локусе генома. Таким образом, применение аденосателлитных векторов поможет в будущем оптимизировать технологию направленной гомологической рекомбинации, которая может быть использована для лечения генных заболеваний.

Заболевания костной ткани, в том числе остеопороз, достаточно широко распространены в настоящее время. Одним из факторов, влияющих на их развитие, является трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β). Оказалось, что данный фактор ингибирует апоптоз, препятствуя преждевременной гибели клетки и вырождению костной ткани. TGF-β запускает каскад реакций с вовлечением целого ряда ферментов, приводящей в конечном итоге к активации NFkB-сигнального пути и способствует выживанию остеокласта за счет увеличения экспрессии белка BclXL и Mcl-1, блокирующего опосредованный каспазами апоптоз. Одной из главных причин развития остеопороза является нарушение нормального протекания цепи реакций, блокирующих запуск NFkB естественных внутриклеточных защитных механизмов и ведущих к гибели клетки при апоптозе.

Плавающие мобильные элементы типа Mariner (MLEs) — широко распространенные транспозоны в геноме эукариот, включая человека. Для транспозиции in vitro требуется транспозаза, а если транспозиция происходит in vivo, то дополнительное влияние оказывают физико-химические факторы. Транспозиция Mos1, впервые открытая у Drosophila mauritiana, способна протекать in vitro при длине транспозона от 80 до 120 п.н. Однако, в работах лаборатории Карин Оже Гуиллу было показано, что высокая температура негативно регулирует транспозицию Mos1, в результате которой вырезанные продукты для транспозиции не способны реинтегрировать. Было также установлено, что сверхспирализация сайта встраивания транспозона, возможно, необходима для эффективности этого процесса. Перспективное направление изучения свойств Mos1 — использование его в качестве вектора для переноса генов.

Одно из направлений исследований группы Питера О`Брайена — поиск механизма, благодаря которому карбонил-удаляющие препараты препятствуют токсичности глиоксаля. Диабет является одним из заболеваний, которое связано с накоплением карбонилированных белков в тканях. Предполагается, что препараты, содержащие тиоловые или амино-функциональные группы, способны к удалению карбонильных групп путем захвата дикарбонилов глиоксаля и метилглиоксаля с образованием нетоксичных соединений. Группа Питера О`Брайена оценила цитопротекторное действие некоторых фармакологических препаратов и витаминов группы В при карбонильном и окислительном стрессах, имеющих место при диабете. Также было показано, что количество конечных продуктов усиленного гликозилирования в тканях и связанные с ними патологии уменьшаются благодаря применению витаминов B1/B6. Установлено, что тиамин (В1) лучше предотвращает гибель клеток, вызванную карбонильным стрессом и митохондриальными токсинами, тогда как В6 более эффективен в от-ношении окислительного стресса и перекисного окисления липидов. В более ранних работах, выполненных на крысах, было продемонстрировано, что дефицит тиамина приводит к увеличению карбонильных соеди-нений. Также Питером О`Брайеном с коллегами проведено исследование оценки цитопротекторных свойств экстрак-ов грецкого и лесного орехов. По выраженности защитных свойств от перекиси водорода, вызывающей гибель клеток, исследователи расположили экстракты в следующем порядке: метаноловый экстракт грецкого ореха > водный экстракт грецкого ореха > липофильный экстракт грец-кого ореха > водный экстракт лесного ореха > метаноловый экстракт лесного ореха. В результате было показано, что аминогуанидин, пеницилламин и цистеин в концентрациях, эквимолярных концентрации глиоксаля, предотвращают карбонилирование белков.

Плавающие мобильные элементы типа Mariner (MLEs) — широко распространенные транспозоны в геноме эукариот, включая человека. Для транспозиции in vitro требуется транспозаза, а если транспозиция происходит in vivo, то дополнительное влияние оказывают физико-химические факторы. Транспозиция Mos1, впервые открытая у Drosophila mauritiana, способна протекать in vitro при длине транспозона от 80 до 120 п.н. Однако, в работах лаборатории Карин Оже Гуиллу было показано, что высокая температура негативно регулирует транспозицию Mos1, в результате которой вырезанные продукты для транспозиции не способны реинтегрировать. Было также установлено, что сверхспирализация сайта встраивания транспозона, возможно, необходима для эффективности этого процесса. Перспективное направление изучения свойств Mos1 — использование его в качестве вектора для переноса генов.