В лаборатории Мэтью Протеуса разработаны нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), способные создавать специфические двуцепочечные разрывы в ДНК клеток млекопитающих, которые в значительной степени стимулируют процесс гомологической рекомбинации. Особенность нуклеаз ZFN заключается в возможности модификации цинко-пальчатых доменов для связывания с различными последовательностями ДНК. В рамках разработки новой технологии были получены ZFNs для прицельной замены последовательности в гене GFP и гене CD8a человека. При сотрудничестве с Sangamo Biosciences (Richmond, CA), синтезирована нуклеаза, мишенью которой является экзон 5- рецептора интрелейкина общей γ-цепи. В гематопоэтических клетках такие нуклеазы вносят двуцепочечные разрывы с частотой 5–18%. Также в сотрудничестве с Sangamo сейчас разрабатывается нуклеаза, мишенью которой является локус β-глобина человека. Нуклеаза ZFN отличается от нуклеазы I-SceI своей цитотоксичностью при экспресиии в клетках млекопитающих. Она, возможно, обусловлена рестрикционной активностью вне сайта узнавания. Поэтому основные усилия направлены на преодоление цитотоксичности нуклеаз ZFN, что может быть достигнуто двумя путями — выявлением возможных сайтов — «немишеней» и их использования для вставки чужеродной ДНК, а также повышение специфичности и уровня экспрессии этих нуклеаз в клетке. Для повышения частоты направленной гомологической рекомбинации возможно применять аденосателлиты совместно с нуклеазами, которые могут повышать частоту рекомбинации в 100 раз. Теоретически возможно создание ZFN для направленной гомологиче-ской рекомбинации в любом локусе генома. Таким образом, применение аденосателлитных векторов поможет в будущем оптимизировать технологию направленной гомологической рекомбинации, которая может быть использована для лечения генных заболеваний.
Место работы — Отдел гематологии и онкологии центра Симмонса по изучению рака (Children’s — Hematology-Oncology Simmons Comprehensive Cancer Center, Dallas), США
Контакты — 5323 Harry Hines Blvd, Dal-las, TX 75390–9063, USA (214) 648-3896matthew.porteus@utsouthwestern.edu
Публикации — Mammalian Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases. Porteus MH. Mol Ther. 2006 Feb;13(2):438-46Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Porteus MH, Baltimore D. Sci-ence. 2003 May 2;300(5620):763 Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks. Porteus MH, Cathomen T, Weitzman MD, Baltimore D. Mol Cell Biol. 2003 May;23(10):3558–65.
Исследовательские группы
Портеус, Мэтью