Клеточная биология

Добавление к культуре фибробластов всего четырех факторов: Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4, — приводит к перепрограммированию клеток. Этот метод эффективен и в отношении эмбриональных, и в отношении зрелых фибробластов. Полученные клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS) обладали морфологией и способностью к пролиферации, свойственной эмбриональным стволовым клеткам, и экспрессировали маркеры эмбриональных стволовых клеток. Подкожное введение iPS мышам провоцировало образование опухолей, содержащих участки тканей всех трех зародышевых слоев, а iPS, введенные в мышиные бластоцисты, участвовали в формировании эмбриона. iPS человека обладают многими свойствами эмбриональных стволовых клеток: морфологией, способностью к пролиферации, поверхностными антигенами, эпигенетическим статусом генов, специфических для плюрипотентного состояния, теломеразной активностью. В in vitro экспериментах и в опытах с тератомами было показано, что iPS могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых слоев. В первых экспериментах доставка необходимых для перепрограммирования факторов осуществлялась с помощью ретровирусных векторов, обладающих способностью интегрироваться в геном, чреватой канцерогенезом. В 2008 году была разработана методика введения Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4 в клетки посредством кДНК. Таким образом, были получены iPS, введение которых не грозит образованием тератом. Вторым фактором, увеличивавшим потенциальный риск образования опухолей при введении в организм, являлся с-Myc. Для устранения этой проблемы была разработана методика получения iPS без использования c-Myc, являющаяся менее эффективной, но более безопасной. В качестве основы для получения iPS можно использовать не только фибробласты, но и клетки печени и желудка. Успех опытов на мышиных фибробластов удалось повторить в экспериментах с фибробластами человека. Добавление все тех же четырех факторов: Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4, — приводило к образованию iPS. Таким образом, в 2007 году эмбриональные стволовые клетки впервые были получены из соматических клеток без использования эмбрионального материала.

Научной группой Кевина Эггана было показано, что для перепрограммирования путем переноса ядра можно использовать эмбриональные стволовые клетки. Анализ транскрипционной активности, активации репортерных генов, аллель-специфической экспрессии генов и профиля метилирования показал, что соматический геном был перепрограммирован в эмбриональное состояние после слияния с эмбриональной стволовой клеткой. В обоих случаях перепрограммирование прошло успешно, что доказывается возможностью получения мозаичных клонов на основе перепрограммированных CD4+ Т-лимфоцитов. Это соединение является ингибитором Tgf-бета сигнального каскада, которое способствует перепрограммированию путем индукции транскрипционного фактора Nanog. Лабораторией Кевина Эггана была исследована степень метилирования ДНК iPS. Выяснилось, что метилирование цитозина в них выше, чем в случае эмбриональных стволовых клеток. Было найдено 288 областей, по-разному метилированных в iPS и фибробластах. В лаборатории удалось получить iPS из клеток 82-летней пациентки с наследственной формой бокового амиотрофического склероза. Полученные iPS обладали свойствами эмбриональных стволовых клеток и были использованы для успешного получения двигательных нейронов — именно того типа клеток, который разрушается при боковом амиотрофическом склерозе. Впервые была показана возможность использования для перепрограммирования соматических ядер зиготы, остановленной в митозе и эмбриональных клеток, взятых на стадии двух бластомеров. Для снижения риска канцерогенеза нужно избавиться от необходимости доставки генов, необходимых для перепрограммирования, с помощью вирусов. В лаборатории Эггана было найдено соединение, которое может заменить Sox2. Эксперименты Эггана показали, что возраст пациента не является препятствием для получения iPS на основе его клеток.

Исследователи в лаборатории Кристи Уолтер выясняют репаративную активность ферментов в тканях мышей разного возраста. Так, изучая половые (сперматогониальные) клетки трансгенных мышей, они обнаружили повышение частоты мутаций при старении животного. Кроме того, у молодых мышей значительно лучше работают ферменты репарации. Сходный эффект имеет место и для человека. Исследование ядерных экстрактов сперматогониальных клеток молодых мышей, мышей среднего возраста и старых особей показало снижение активности репаративных ферментов с возрастом. Самая высокая активность ферментов репарации показана для половых клеток, клеток Сертоли(соматические клетки, расположенные в извитых канальцах семенников млекопитающих). Тимоциты, клетки тонкого кишечника и печени тоже обладают высокой активностью этих ферментов. Самая низкая активность обнаружена в мозге. Причем, наиболее активным в мозге и печени оказался фермент ДНК-лигаза I. При этом активность восстанавливается при добавлении ДНК-гликозилазы и ДНК-лигазы, полученных из клеток молодых особей.

Ученые группы Фионы Уатт показали, что количество и функции эпидермальных стволовых клеток не изменяется с возрастом, и что местное окружение (ниша) и системные факторы влияют на старение кожи и активность стволовых клеток. Это связано с уменьшенной экспрессией гена Igfbp3 в дерме. С возрастом экспрессия этого гена уменьшается практически в 5 раз, что напрямую влияет на пролиферативную способность эпидермиса. Это было доказано с использованием нокаутных мышей. Таким образом, была показана прямая зависимость стволовых клеток от их ниш, и исследован молекулярный механизм, контролирующий активность эпидермальных стволовых клеток.

Получившиеся после перепрограммирования клетки обладали нормальным кариотипом, в них была выявлена теломеразная активность, детектированы поверхностные антигены и маркеры, характерные для эмбриональных стволовых клеток. Было доказано, что получающиеся таким образом клетки, могут дифференцироваться во все три зародышевых слоя. Это было сделано на примере одного из самых распространенных наследственных неврологических заболеваний — спинально-мышечной атрофии. При этой болезни происходит избирательная потеря двигательных нейронов, ведущая к мышечной слабости и параличу. От пациента были взяты фибробласты, на основе которых получены iPS. Получившиеся клетки имеют тот же генотип, что и пациент, их можно длительное время поддерживать в культуре, и такие клетки могут быть дифференцированы в двигательные нейроны с признаками патологии. Таким образом, iPS могут стать прекрасной моделью для изучения наследственных и других заболеваний. В лаборатории Джеймса Томпсона было показано, что для перепрограммирования можно использовать несколько иной набор факторов, а именно Oct4, Sox2, Nanog и Lin 28. Было показано, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть использованы для моделирования заболеваний человека. Также Томпсоном с соавторами была разработана новая система доставки факторов перепрограммирования в клетки с помощью oriP/EBNA1 эписомального вектора. Преимуществом такого способа является возможность бесследного удаления внесенных генов после перепрограммирования.

У макроскопических организмов процесс старения очевиден, тогда как у одноклеточных, которые являются потенциально очень ценными видами для установления механизмов старения, различать и оценивать старение очень сложно. Основные результаты в этой области были получены у организмов, обладающих очевидно асимметричным делением, а также легко различимой ювенильной фазой развития. Так как репродуктивное старение может быть связано с неравнозначным распределением «старых» и «молодых» компонентов между родителем и потомством, считалось, что организмы, у которых эта черта отсутствует, не стареют, следовательно, обладают функциональным бессмертием. При помощи автоматической микроскопии Таддей с коллегами изучили последовательные циклы размножения отдельных клеток Escherichia coli, бактерии, у которой отсутствует ювенильная фаза, а деление симметрично. Авторы пришли к выводу, что клетки, считавшиеся равнозначными после деления, являются функционально асимметричными. Таким образом, клетка, получающая «старый» полюс, может рассматриваться как родительская. Эти результаты позволили авторам сделать вывод, что ни одна из известых жизненных стратегий не является устойчивой к эффектам старения. Ученые показали, что клетка, которая наследует «старый» полюс, характеризуется снижением скорости роста, сниженной способностью к воспроизведению и повышенной частотой смертности.

Клетки микроглии способны удалять окисленные белки из внеклеточного окружения и расщеплять конечные продукты гликозилирования, накапливающиеся в процессе старения. Для изучения старения клеток микроглии была разработана методика культур первичных микроглиальных клеток из взрослых организмов. На таких культурах было показано, что метаболизм старых микроглиальных клеток отличается от такового в клетках новорожденных: нарушено обновление белков, снижена активность протеасомы (однако содержание протеаз не меняется), повышается количество белков, расположенных на поверхности клетки, увеличивается базальный уровень выделения NO.Также у состарившихся клеток микроглии снижается способность удалять нерастворимые белковые агрегаты, накапливающиеся в процессе старения. Преинкубация клеток с витамином Е существенно улучшает их активность. Изучение старения мезенхимальных клеток важно для создания и усовершенствования методов аутологичной терапии, поскольку именно пожилые люди более подвержены дегенеративным заболеваниям. Группой Александры Стольцинг было показано, что с возрастом, с одной стороны, происходит не только уменьшение числа прогениторных мезенхимальных клеток, но и ухудшение их «качества»: повышается концентрация кисленных белков и липидов, снижается активность антиоксидантных ферментов, способности к пролиферации и дифференцировке. Культивирование мезенхимальных клеток лучше вести при пониженной температуре. В таких условиях в клетках снижается количество активных форм кислорода, NO, карбонила и липофусцина, повышается активность супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, концентрация проапоптотических факторов (HSP-60) снижается, а противоапоптотических факторов (HSP-27, HSP-70, HSP-90) — повышается. Мезенхимальные клетки перспективны с точки зрения кле-точной терапии дегенеративных заболеваний. Таким образом, пониженная температура культивирования мезенхимальных клеток влияет на их антиоксидантные свойства.

Используя данные, полученные на мышах, не продуцирующих остеопонтин (неколлагеновый адгезивный матриксный белок, OPN), и при применении экзогенного остеопонтина, исследователи показали влияние OPN на гематопоэтические стволовые клетки (ГСК). При отсутствии остеопонти-на количество ГСК увеличивалось, поскольку усиливалась экспрессия Jagged1 и ангиопоэтина-1 и, кроме того, уменьшалось количество апоптотических примитивных гемопоэтических клеток. Активация микроокружения стволовых клеток паратиреоидным гормоном уменьшала экспрессию OPN и останавливала увеличение количества стволовых клеток в его отсутствие. Таким образом, остеопонтин негативно регулирует количество гемапоэтических стволовых клеток, и это доказывает ключевую роль остеобластов, как клеток ниши стволовых клеток, в регуляции ГСК.

1. Трансплантация клетки / Доставка лекарств Клетки млекопитающих могут быть микрокапсулированы в пределах биологически совместимой мембраны полимера, чтобы облегчить их трансплантацию. Полимер, будучи проницаемым для глюкозы и других питательных веществ, позволяет клеткам оставаться жизнеспособными и функционировать нормально (например, секретировать гормоны). Однако, мембрана непроницаема к более высокомолекулярным антителам. Сохранить жизнеспособность клеток в течение инкапсулирования (например, при воздействии на них органических растворителей) чрезвычайно трудно. Научная группа Сефтона участвует в создании новых полимеров и проектировании более эффективных процессов для производства капсул, занимается модуляцией иммунного и воспалительного ответа, использующего генетически измененные клетки в этих капсулах после внедрения.2. Разработка биоматериаловГруппа профессора Сефтона также исследует совместимые с кровью материалы. В подготовке устройств, которые используются в контакте с кровью (например, искусственное сердце, пересадка тканей, относящихся к сердечно-сосудистой системе, катетеры), должны использоваться методы растворения сгустков крови или предотвращения их формирования. Для предотвращения сгущения крови применяются антикоагулянтов (гепарин), однако их прием может привести к чрезмерному кровотечению. В прошлом подход профессора Сефтона состоял в том, чтобы ковалентно связать гепарин с материальной поверхностью, с помощью слоя покрытия поливиниловым спиртом (ПВА). Это предотвращало свертывание крови, но не решало проблемы эмболизации (закупорки сосуда) и потребления тромбоцитов. Поэтому исследовательская группа изучает причины реактивности ПВА и ведет поиск альтернтивных вариантов. Основу для этих исследований составляют цитометрия потока и другие базированные на иммунологии методики. Группа профессора Сефтона также изучает связи между коагуляцей, тромбоцитами и активацией лейкоцитов и дополнительной активацией.3.Тканевая инженерия. Университет Торонто является международным лидером тканевой инженерии. Для тканевых разработок здесь создаются мультидисциплинарные команды, состоящие из ведущих ученых, инженеров и клиницистов, членом которых является профессор Сефтон. Для решения этой проблемы группа профессора Сефтона разработала биологически совместимый полимер (poly HEMA-MMA), который подобен мягкому материалу контактной линзы. Результаты этих исследований в совокупности со знаниями о клеточной инкапсуляции помогут понять механизм воспаления, связанного с биоматериалом.

Болезнь Хантигтона связана с удлинением полиглутаминового участка гена хантингтина. Эта мутация приводит к образованию продукта с неправильной конформацией, который накапливается в цитоплазме, формируя токсичные для клетки агрегаты. На модельных системах удалось показать, что подавление аутофагии ускоряет образование таких агрегатов, а стимуляция — снижает скорость образования новых агрегатов и способствует разрушению уже существующих. Для стимуляции аутофагии используется рапамицин -ингибитор mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих), который в свою очередь является ключевым ингибитором аутофагии в клетке. В опытах на D. melanogaster было показано, что рапамицин защищает от нейродегенерации. Аналог рапа-мицина, CCI-779, повышал результаты мышей с модельной болезнью Хантигтона в четырех различных поведенческих тестах и снижал количество агрегатов в мозге. В настоящее время рапамицин используется в качестве иммуносупрессанта для предотвращения отторжения органов при пересадке. Наличие у рапамицина иммуносупрессивных свойств, а также побочных эффектов, делает актуальной задачу поиска других препаратов-стимуляторов аутофагии. Таким образом, индукторы аутофагии могут иметь важное терапевтическое значение. В результате тестирования 253 соединений был найден ряд препаратов, индуцирующих аутофагию: антагонисты Ca2+ каналов L-типа (верапа-мил, лоперамид, нимодипин, амиодарон), индуктор K+ATP каналов — миноксидил, активатор Gi сигнального пути — клонидин, и другие.