Биомедицина

Отдел доктора Азеа изучает активность hsp с целью разработки эффективных иммунотерапевтических подходов с использованием этих белков. Эта группа впервые обнаружила, что экзогенный hsp70 обладает высокой цитокиновой активностью Ученые установили, что широко используемые адаптогены могут оказывать влияние на плазменный уровень hsp. Экстракты элеутерококка, родиолы розовой и лимонника китайского при постоянном приеме (опыты проводились на мышах) приводят к возрастанию плазменного уровня hsp72. Таким образом, прием адаптогенов воспринимается организмом как своеобразный стресс, при этом повышается устойчивость организма к реально озникающим стрессовым ситуациям. Также ими была оценена роль hsp в долголетии. Они предположили, что уровень hsp70 у долгожителей и их потомков должны отличаться от таковых у контрольных индивидов.

Добавление к культуре фибробластов всего четырех факторов: Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4, — приводит к перепрограммированию клеток. Этот метод эффективен и в отношении эмбриональных, и в отношении зрелых фибробластов. Полученные клетки, названные индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS) обладали морфологией и способностью к пролиферации, свойственной эмбриональным стволовым клеткам, и экспрессировали маркеры эмбриональных стволовых клеток. Подкожное введение iPS мышам провоцировало образование опухолей, содержащих участки тканей всех трех зародышевых слоев, а iPS, введенные в мышиные бластоцисты, участвовали в формировании эмбриона. iPS человека обладают многими свойствами эмбриональных стволовых клеток: морфологией, способностью к пролиферации, поверхностными антигенами, эпигенетическим статусом генов, специфических для плюрипотентного состояния, теломеразной активностью. В in vitro экспериментах и в опытах с тератомами было показано, что iPS могут дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых слоев. В первых экспериментах доставка необходимых для перепрограммирования факторов осуществлялась с помощью ретровирусных векторов, обладающих способностью интегрироваться в геном, чреватой канцерогенезом. В 2008 году была разработана методика введения Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4 в клетки посредством кДНК. Таким образом, были получены iPS, введение которых не грозит образованием тератом. Вторым фактором, увеличивавшим потенциальный риск образования опухолей при введении в организм, являлся с-Myc. Для устранения этой проблемы была разработана методика получения iPS без использования c-Myc, являющаяся менее эффективной, но более безопасной. В качестве основы для получения iPS можно использовать не только фибробласты, но и клетки печени и желудка. Успех опытов на мышиных фибробластов удалось повторить в экспериментах с фибробластами человека. Добавление все тех же четырех факторов: Oct3/4, Sox2, c-Myc и Klf4, — приводило к образованию iPS. Таким образом, в 2007 году эмбриональные стволовые клетки впервые были получены из соматических клеток без использования эмбрионального материала.

Многие заболевания митохондрий вызваны структурными и функциональными изменениями комплекса I. Поэтому основной целью исследований группы Такао Яги является разработка терапии для компенсации дефекта этого комплекса. Наиболее перспективным методом является трансфекция геном НАДН дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), который состоит из одной субъединицы (Ndi1) для переноса электронов на убиквинон-10 в митохондриях млекопитающих. При использовании линии мутантных клеток китайского хомячка CCL16-B2 с дефектным геном, кодирующим комплекс I, сотрудники лаборатории Такао Яги успешно провели трансфекцию митохондрий этих клеток геном NDI1. В трансфицированных клетках с функционально активной дегидрогеназой NDI1 и здоровых клетках (контроль с интактным геном комплекса I) отмечали перенос электронов при использовании в качестве субстратов глутамата и малата. Поэтому трансфекция геном NDI1 открывает новые возможности для лечения митохондриальных заболеваний с помощью генной терапии.

Один из видов гистоновых диацетилаз — сиртуин SIRT1 вовлечен в многочисленные биологические процессы, имеющие и положительное и отрицательное значение. Сиртуины были открыты в связи с их значением для увеличения продолжительности жизни (в культуре дрожжей). Наиболее исследованный представитель этого семейства SIRT1 участвует во множестве процессов, включая апоптоз, старение, гомеостаз липидов и глюкозы, секрецию инсулина и аксональную деградацию. Было выяснено также, что SIRT1, по-видимому, играет критическую роль в процессе возникновения некоторых опухолей, особенно в возникновении возрастных неоплазм. В работах американских ученых исследуются взаимодействия сиртуина SIRT1 и мелатонина в поддержании циркадных ритмов, и их значение в процессах старения и образования рака. Изменения в циркадных ритмах и продукции эпифизом гормона мелатонина связаны с риском возникновения рака и старением. Прием мелатонина может способствовать ингибированию сиртуина SIRT1, что может быть причиной антиракового эффекта мелатонина.

Известно, что при ограничении калорийности питания у лабораторных мышей повышается эффективность работы иммунной системы на фоне уменьшения общего количества иммунных клеток. Исследователи выяснили, что иммунитет и старение тесно взаимосвязаны, а именно причиной улучшения работы иммунной системы является уничтожение стареющих Т-клеток. Для того чтобы подробнее изучить взаимосвязь иммунитета и старения и выяснить, активизируется ли у стареющих «голодающих» мышей апоптоз Т-клеток, они исследовали три группы мышей: молодых, старых и старых «голодающих» мышей. Апоптоз Т-клеток индуцировали с помощью теплового шока, антител к CD3 и стауроспорина. При этом у молодых мышей всякий раз апоптоз шел эффективнее, чем у старых. Однако у той группы старых мышей, которые получали меньшее количество калорий с пищей, наблюдалась нормализация апоптоза. Таким образом, нормализация апоптоза нефункционирующих сенесцентных Т-лимфоцитов у старых «голодающих» мышей может быть причиной улучшения состояния их иммунной системы. В лаборатории профессора Риты Эфрос изучаются механизмы старения иммунной системы, т. е. ее клеток, вызванные возрастом или хроническими вирусными инфекциями. Особый упор делается на изучение возрастных изменений в функции теломерных участков хромосом и использовании полученных результатов для выработки новых терапевтических и генотерапевтических подходов для улучшения иммунной функции стареющих лимфоцитов. Теломераза — фермент, который транскрибирует теломерную ДНК на концах линейных хромосом и тормозит старение иммунной системы на клеточном уровне. В отличие от большинства нормальных соматических клеток, в которых теломеразная активность очень низка или вообще отсутствует, в иммунных клетках теломераза очень активна. Тем не менее, по мере возрастного старения или в условиях хронической инфекции вируса иммунодефицита человека возрастает доля CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов с нарушенной функцией, имеющих укороченные теломеры, что свидетельствует о резком снижении теломеразной активности в этих клетках. Этот феномен снижает функционирование систем организма и влечет за собой проблемы, изучаемые в иммунологии, а именно способствует развитию опухолей и ускоряет процесс старения. Было показано, что обработка Т-клеток молекулами ТАТ2 или экспрессия трансгенной теломеразы замедляла укорочение теломер, увеличивала пролиферативный потенциал и, что важно, усиливала продукцию цитокинов и хемокинов и антивирусную активность. Экспрессия трансгена, содержащего главную каталитическую субъединицу теломеразы человека, или прием активатора теломеразы-2 (ТАТ2) приводила у улучшению иммунных свойств CD8+ Т-клеток у хронических больных синдромом приобретенного иммунодефицита. Полученные результаты открывают новый подход, основанный на использовании теломеразы или активаторов теломеразы, для восстановления и усиления иммунной функции при хронических вирусных инфекциях, а также изучаемых в иммунологии пищевых аллергий, заболеваний костного мозга и др.

Результаты исследований группы профессора Эппле показывают, что снижение эффективности работы митохондрий (но не их количества) играет важную роль в ухудшении аэробных функций скелетной мускулатуры при старении. Интересным фактом является то, что длительные ограничения калорийности снижают сокращение скелетной мышечной массы и ее аэробной функции по мере старения. Группа Рассела Эппле сравнивала уровень окисления белков и компонентов протеасомного пути при избыточном кормлении и при ограничении калорийности питания на примере подошвенной мышцы (musculus plantaris) крыс. Оказалось, что при ограничении калорийности с возрастом у крыс не наблюдалось накопления карбонилированных белков, характерных для крыс без ограничения кормления. Параллельно с возрастом в обоих случаях возрастали уровни убиквитин-лигаз MuRF1 и MAFbx, хорошо известных участников сигнального каскада, приводящего к развитию мышечной атрофии. С другой стороны, химотрипсиновая активность протеасом с возрастом увеличивалась только в случае ограничении калорийности, при том, что экспрессия протеасомной субъединицы С2 возрастала одинаково в обеих группах. Также интересно, что у самых старых животных обеих групп мышечная масса была ниже, чем этого можно было бы ожидать исходя из уровня их протеасомной активности. Таким образом, одной из главных задач является выявление молекулярных механизмов, посредством которых ограничение калорийности защищает функции митохондрий при старении. Также предстоит выяснить в какой степени физические нагрузки могут имитировать этот защитный эффект. Результаты исследований показали, что ограничение калорийности способствует снижению уровня модифицированных белков и осуществлению протеасомного сигнального пути. Это может иметь большое прикладное значение, так как продемонстрирована связь ограничения калорийности и замедления развития мышечной атрофии. Необходимо дальше изучать молекулярные механизмы этих эффектов.

Уильям Эндрюс был одним из первооткрывателей одновременно РНК и белкового компонентов в теломеразе человека, и был удостоен за эту работу Национальной премии за лучшую инновацию. Сейчас он сфокусирован на исследованиях, направленных на индуцирование экспрессии генов, задействованных в работе теломеразы.Под его руководством проводится скрининг веществ, которые способны активировать ген, препятствующий укорочению теломер в соматических клетках человека. Несколько лет назад Эндрюс и его коллеги внедрили ген теломеразы в клетки кожи человека, у которых были очень короткие теломеры. За-тем эти клетки имплантировали для выращивания в кожу на спине мыши. Кожа, сформированная из клеток без гена теломеразы, выгладела старой, морщинистой, хрупкой. Кожа, выращенная из клеток, в которые был внедрен ген теломеразы, выглядела молодой. Показатели уровня экспресии генов соответствовали молодому возрасту. В ноябре 2008 года была опубликована работа, в которой описывался процесс создания клонированной мыши из клеток, содержащих внедренный ген теломеразы и продуцирующих фермент теломеразы. Было показано, что эти мыши жили дольше на 50%, по сравнению с клонированными мышами, созданными из клеток, не содержащих этот ген. Тогда стало ясно, что предотвращение укорочения теломер, возможно, лучший путь для создания антивозрастной терапии.Внедрение гена напрямую в ДНК, используя вирусные векторы, – не очень жизнеспособная идея, поскольку это может вызвать рак. Однако ген теломеразы уже существует во всех наших клетках, поскольку ДНК всех клеток идентична – мышцы, кожа, печень содержат одну и ту же генетическую информацию. Причина, почему соматические клетки, в отличие от репродуктивных, не продуцируют теломеразу, в том, что у них этот ген подавлен. Есть один или два участка ДНК, соседствующих с геном теломеразы, которые связывают продуцируемый ими белок, и если это происходит, то клетки не могут создавать теломеразу. Подобные вещества недавно были открыты. Один из них ТА-65 – в Кор-порации Герон и на данный момент лицензирован Sierra Sciences. Эта компания, используя роботизиро-ванный высокоскоростной метод сканирования веществ, обнаружила около 200 веществ в 29 различных группах лекарственных препаратов, которые индуцируют теломеразную активность в нормальных клетках.Но «совершенное» лекарство, под-ходящее человеку, еще не найдено. Ни одно из веществ не индуцируют теломеразу в достаточно больших количествах, чтобы увеличить продолжительность жизни клетки. Некоторые – токсичны (кроме ТА-65).Предполагается продолжить скрининг (примерно 4000 веществ в неделю), провести сравнительные исследования отобранных веществ и на основе этого создать препарат, продлевающий жизнь соматическим клеткам человека. На данный момент отобрано 33 вещества, которые могут стать основой для препарата, блокирующего супрессию «гена теломеразы». Однако подавленный белок можно «выманить», используя маленькие молекулы, которые воздействуют на этот супрессор и не дают ему атаковать ДНК. Если будет найдено подходящее вещество, содержащее эти молекулы, то это, возможно, «включит» теломеразную активность в каждой клетке человеческого тела.

Вопреки распространенному мнению о статичности мозга млекопитающих, процессы нейрогенеза во взрослом, зрелом мозге оказались реальностью. К нейрогенезу способны лишь некоторые зоны мозга взрослого организма (обонятельная луковица и зубчатая извилина гиппокампа), вместе с тем, в разных частях зрелого мозга может существовать достаточно большое количество стволовых клеток предшественников. Джейсон Эмсли участвовал в исследованиях, которые продемонстрировали, что новые нейроны могут добавляться к уже созревшим неокортикальным нейронным сетям. Это может быть связано с пересадкой нейронов образованных от нервных клеток предшественников или через манипуляцию эндогенных предшественников (включая индукцию ограниченного нейрогенеза длинно-дистантных проекций корковых нейронов на взрослых мышах). Учитывая разнородность подтипов нейронов в коре млекопитающихся и сложность их связей, попытка восстановления функционально-сохранной нейронной сети требует детального понимания значимости сигналов, направленных на дифференцирование нейронов, соединения, и выживание их отдельных типов. Были выделены связанные с развитием регулируемые транскрипционные факторы для определенных типов нейронов, достаточно отличающиеся друг от друга (для моторных, кортикоталамических нейронов и нейронов мозолистого тела). Ген-специфический анализ подтипов нейронов коры мозга определил существование программы комбинации молекулярного-генетического контроля точного развития ключевых корковых проекций нейронной популяции. Есть надежда, что со временем можно будет стимулировать дифференциацию нейронов из предшественников и в других областях мозга, рассчитывая на локальный терапевтический эффект не противоречащий гетерогенности исходного материала для лечения нейродегенеративных заболеваний и травм головного мозга. При различных заболеваниях и травмах принципиально возможен клеточный ремонт поврежденной нейронной корковой сети, если известны и понятны межанизмы дифференциации нейронов. Результаты этих исследований важны для направленного контроля дифференециации нейронных предшественников (стволовых клеток) относительно функционального восстановления ЦНС.

Изменения, происходящие у старых животных с митохондриями, включают существенное уменьшение мембранного потенциала. В мем-бране митохондрий уменьшается уровень кардиолипина — важного фосфолипида, который является кофактором для ряда важных мито-хондриальных транспортных белков, уменьшается количество коэнзима Q10 и карнитина который важен для бета-окисления жирных кислот. В лаборатории возглавляемой профессором Эймсом было показано, что ацетил-карнитин улучшает состояние старых животных непосредственно влияя на митохондрии. Также на состояние митохондрий влияла альфа-липоевая кислота. Как и карнитин она увеличивала мембранный потенциал старых крыс и устраняла часть повреждений, связанных с возрастными изменениями организма у старых животных. И кроме тогопри получении подопытными жи-вотными альфа-липоевой кислоты увеличивалось в митохондриях количество глутатиона и витамина С — естественных антиоксидантов. Изоформа альфа-липоевой кислоты: R-альфа-липоевая кислота — оказывалась эффективней обычной альфа-липоевой кислоты в десять раз. Ацетил-карнитин восстанавливает у старых мы-шей мембранный потенциал до такого же уровня как у молодых животных, облегчает транспорт жирных кислот в митохондрии и увеличивает интенсивность клеточного дыхания. R-альфа-липоевая кислота может быть простым и эффективным путем для улучшение общей метаболической активности и борьбы с повреждениями, наносимыми активными формами кислорода.

Научной группой Кевина Эггана было показано, что для перепрограммирования путем переноса ядра можно использовать эмбриональные стволовые клетки. Анализ транскрипционной активности, активации репортерных генов, аллель-специфической экспрессии генов и профиля метилирования показал, что соматический геном был перепрограммирован в эмбриональное состояние после слияния с эмбриональной стволовой клеткой. В обоих случаях перепрограммирование прошло успешно, что доказывается возможностью получения мозаичных клонов на основе перепрограммированных CD4+ Т-лимфоцитов. Это соединение является ингибитором Tgf-бета сигнального каскада, которое способствует перепрограммированию путем индукции транскрипционного фактора Nanog. Лабораторией Кевина Эггана была исследована степень метилирования ДНК iPS. Выяснилось, что метилирование цитозина в них выше, чем в случае эмбриональных стволовых клеток. Было найдено 288 областей, по-разному метилированных в iPS и фибробластах. В лаборатории удалось получить iPS из клеток 82-летней пациентки с наследственной формой бокового амиотрофического склероза. Полученные iPS обладали свойствами эмбриональных стволовых клеток и были использованы для успешного получения двигательных нейронов — именно того типа клеток, который разрушается при боковом амиотрофическом склерозе. Впервые была показана возможность использования для перепрограммирования соматических ядер зиготы, остановленной в митозе и эмбриональных клеток, взятых на стадии двух бластомеров. Для снижения риска канцерогенеза нужно избавиться от необходимости доставки генов, необходимых для перепрограммирования, с помощью вирусов. В лаборатории Эггана было найдено соединение, которое может заменить Sox2. Эксперименты Эггана показали, что возраст пациента не является препятствием для получения iPS на основе его клеток.