Молекулярная биология

Лаборатория Денгшун Ванга изучает механизмы, лежащие в основе нейродегенеративных заболеваний, в т. ч. болезни Альцгеймера. Характерными показателями болезни Альцгеймера являются амилоидные бляшки и нейрофибриллярные включения, которые приводят к гибели нейронов и прогрессирующим когнитивным ухудшениям. Недавно стало известно, что появление амилоидных бляшек и скрученных нейрофиламентов — результат образования поперечных сши-вок между различными белками. Исследователи показали, что трансглутаминаза сшивает и тау-белки, которые в норме регулируют образование филаментов в цитоплазме клеток. При образовании сшивок всего по нескольким глутаминовым остаткам, молекулы тау-белка образуют агрегаты, которые деформируют нормальную структуру нейрофиламентов. Более того, трансглутаминаза катализирует образование сшивок собственно между белками нейрофиламентов. При наследственной форме болезни агрегаты амилоидного белка могут служить долговременными стимуляторами трансглутаминаз и способствовать прогрессированию заболевания уже без исходных факторов. По последним сведениям, фер-мент трансглутаминаза, участвующий в образовании сшивок, приводит к такой агрегации белков при болезни Альгеймера. Такие факторы, как травма, воспаление, ишемия или стресс повышают уровень и активность трансглутаминазы, что может привести к развитию спонтанной болезни Альцгеймера.

Одна из работ этой лаборатории посвящена фактору транскрипции STAT3, который играет важную роль во многих физиологических процессах. Он также является ключевым белком в программе самообновления эмбриональных стволовых клеток и незаменим на стадиях раннего эмбриогенеза млекопитающих, поскольку развитие многих органов требует активации STAT3. Используя разные вектора, экспрессирующие ген флуоресцентного белка или люциферазы, учёным удалось показать, что для нормального функционирования эмбриональных клеток необходима низкая активность STAT3, а во время дифференцировки она, наоборот, должна повыситься. Учёные выдвигают предположение, что, вызывая экспрессию STAT3 (например, при помощи малых РНК) можно определять судьбу эмбриональных стволовых клеток.

Одним из сопутствующих признаков болезни Паркинсона является модификация убиквитин-С-концевой гидролазы L1 (UCH-L1). При ее карбонилировании развивается спорадическая форма заболевания, а при мутации I93M — наследственная. Ученые выяснили, что и нормальный и мутантный фермент UCH-L1 способен взаимодействовать с белками аппарата шаперон-зависимой аутофагии, причем как с LAMP-2A, так и с hsc70. При этом мутация I93M значительно усиливает такое взаимодействие. Это ведет к замедлению шаперон-зависимой аутофагии. Как следствие — в клетках происходит избыточное накопление альфа-синуклеина и развивается болезнь Паркинсона. Помимо этого, в клетке происходит накопление GAPDH, одного из ферментов, участвующего в активации апоптоза. Возникновение и развитие болезни Паркинсона протекает по одной и той же схеме, но исходная причина возникновения болезни может оказаться принципиально различной. Более того, вызывающие болезнь факторы могут взаимно дополнять и усиливать действие друг друга, вызывая обострение болезни.

Ученые группы Ричарда Букалы изучают уровень накопления продуктов неэнзиматического гликозилирования у пациентов с различными возраст-зависимыми заболеваниями. В ходе исследования ученые определяли количество продуктов неэнзиматического гликозилирования у пациентов с обструктивным ночным апноэ (119 человек), не болеющих диабетом, среди больных диабетом второго типа (134 человека) и среди здоровых людей (234 человека — контрольная группа). В результате было обнаружено, что уровень продуктов неэнзиматического гликозилирования был увеличен в сыворотке крови пациентов с диагнозом апноэ в сравнении с контролем, но самым высоким уровень был среди больных сахарным диабетом второго типа. Интересно, что количество продуктов неэнзиматического гликозилирования коррелировало с длительностью ночных задержек, содержанием 8-изопростана в плазме (биохимический маркер оксидативного стресса), но не с уровнем глюкозы. Ученые также выяснили, что продукты неэнзиматического гликозилирования играют роль в воспалительных процессах, сосудистых патологиях, изменениях структуры стекловидного тела и нефропатиях, связанных с сахарным диабетом и процессами старения. Важность научной работы группы Ричарда заключается в детальном исследовании механизмов влияния продуктов неэнзиматического гликозилирования на иммунную систему, структуру сосудов, стекловидного тела, работу почек при старении и различных возрастных заболеваниях.

По мнению Энн Брюне, то, что фактор FOXO регулирует гены стрессоустойчивости и одновременно про-апоптотические гены — не парадокс. FOXO факторы могут организовать различные образцы экспрессии гена, в зависимости от интенсивности внешнего воздействия. Возможно, в мягких условиях они активизируют гены стрессоустойчивости, а когда интенсивность стимулов напряжения превышает некоторый порог — активизируют про-апоптотические гены. Также возможно, что FOXO факторы регулируют различные гены в различных типах клеток, вызывая апопотоз в некоторых из них (например, нейроны, лимфоциты) при стимуляции выживания в других. Важно, что индукция aпоптоза фактором FOXO может вызвать смерть поврежденных или неправильных клеток, поэтому способствует долговечности целого организма. Результаты исследований группы Энн Брюне показали, что: — фермент SIRT1 оказывает двойное воздействие на функции FOXO3: SIRT1 повышает способность FOXO3 вызывать у клетки устойчивость к окислительным стрессам, но препятствует способности FOXO3 вызывать гибель клеток. Таким образом, один из путей, которым белки семейства Sir2 могут продлить жизнь организма — это изолирование FOXO- зависимых ответов от апоптоза, не затрагивая связь этих ответов со стрессоустойчивостью. — FOXO факторы играют роль подавителя опухоли в разнообразных раковых образованиях. Эффективный контроль за деятельностью FOXO в ответ на стимулы окружающей среды может иметь решающее значение для предотвращения старения и возраст-зависимых заболеваний, включая рак, нейродегенеративные заболевания и диабет.

Хеликазы играют важную роль в поддержании стабильной структуры ДНК.Это стало очевидным, когда выяснилось, что некоторые синдромы, вызывающие преждевременное старение, возникают при отсутствии некоторых хеликаз. Так, например, синдром Вернера (Werner) характеризуется ускоренным старением, начиная с периода полового созревания. Продолжительность жизни людей с этим синдромом может достигать 30–40 лет, а смерть наступает при характерных для глубокой старости явлениях угасания функций либо от типичной возрастной патологии, включая рак, сердечную недостаточность, мозговые нарушения и другие заболевания. Синдром Блума (Bloom) возникает очень редко. Дети, страдающие этим заболеванием, рождаются очень маленькими и редко вырастают выше 1,5 метров. Они более подвержены инфекциям дыхательных путей и ушей, и у них выше риск заболевания определенными видами рака. При культивировании лимфоцитов и фибробластов таких больных обнаруживаются многочисленные хромосомные абберации. Так, например, RecQ хеликаза человека Wrn взаимодействует с ДНК-полимеразой и эндонуклеазой при эксцизионной репарации оснований. Исследования показали, что в клетках, в которых отсутствовал белок Wrn, продукты оксидативного стресса (8-оксо-2дезоксогуанин) накапливались быстрее. Ученые выяснили, что хеликаза RecQ необходима для создания «правильного» интермедиата при репликации ДНК. Хеликазы также способны взаимодействовать с белками репарации и влиять на их работу. Терапевтический контроль над уровнем хеликаз может стать одним из решений проблем старения и канцерогенеза.

Основная тема исследований группы Чарльза Бреннера — метаболизм никотинамид аденин динуклеоида (НАД) — молекулы, являющейся коэнзимом для реакций с переносом водорода и субстратом для НАД-зависимых сигнальных ферментов, таких как сиртуины и поли(АДФрибозо)полимеразы. Исследовательская группа под руководством Чарльза Бреннера обнаружила, что недавно открытый витамин — никотинамид рибозид (NR, nicotinamide riboside) — натуральный компонент, найденный в молоке, активирует антивозрастной продукт гена Sir2 дрожжей. Никотинамид рибозид является предшественником в метаболических превращениях молекулы НАД+. Активность сиртуинов зависит от уровня НАД+, поэтому они могут рассматриваться как связующее звено между статусом клеточного метаболизма и адаптивным транскрипционным ответом. В свою очередь, уровень НАД+ повышается при ограничении калорийности питания. Таким образом, можно проследить связь между положительным действием ограничения калорийности питания и сиртуинами. Исследования показали, что никотинамид рибозид способен повышать уровень НАД+ в клетке без введения ограничений в питании, что приводит к активации сиртуинов.

Основными факторами борьбы с гликилированием являются классические антиоксиданты такие, как витамин Е или N-ацетилцистеин. Среди молекул, которые способны противостоять AGE, выделяют такие нуклеофилы как пиридоксамин, тенилсетам, 2,3-диаминофеназон, OPB-9195, метформин и аминогуанидин. Механизм действия этих веществ заключается в ингибировании AGE через инактивацию интермедиатов. Добавление витамина Е в пищу снижает количество гликилированного гемоглобина, уровень перекисного окисления липидов и окисления липидов низкой плотности.

Одной из основных тем исследований в лаборатории Кита Блэквелла является фактор SKN-1 и защитные механизмы, направленные на борьбу с активными формами кислорода. Инсулин ингибирует синтез регуляторного белка SKN-1, активность которого повышает устойчивость к активным формам кислорода и увеличивает продолжительность жизни. Уже было известно, что инсулин также ингибирует регуляторный белок FOXO, контролирующий ряд генов, отвечающих за стрессоустойчивость. Более ранние исследования на C. elegans показали, что подавление инсулинового сигналлинга усиливало активность FOXO (DAF-16) и приводило к повышению стрессоустойчивости и увеличению продолжительности жизни. А ученые группы Кита Блэквелла выяснили, что SKN-1 — второй важный ген, который ингибируется инсулином. Эти эксперименты должны быть повторены на млекопитающих, у которых инсулин и инсулиноподобный фактор роста 1 принимают участие в регуляции экспрессии ряда белков в разных тканях. Однако многие модели, испытанные на C. Elegans, уже полностью повторились при исследованиях на мышах и человеке. Ученые показали, что инсулин оказывает неожиданное и до сих пор неизвестное влияние на продолжительность жизни. Таким образом, манипулируя экспрессией SKN-1 у червей, можно продлить их жизнь.

В 1980 году Блэкберн с коллегами показали экспериментально, что уникальная последовательность ДНК в теломерах защищает хромосомы от разрушения. Затем, в 1985 году Блэкберн впервые экспериментально идентифицировала теломеразу — фермент, образующий теломеры. За эту работу Блэкберн была удостоена Нобелевской премии по медицине и физиологии 2009 г. Эти открытия объяснили, как именно теломеры защищают хромосомы и как они образуются при помощи теломеразы. Однако их роль в процессе старения долго оставалась гипотетической. Известно было лишь, что теломераза перестает работать в дифференцированных соматических клетках взрослого человека, сохраняя свою активность в половых и стволовых клетках, а также в клетках большинства опухолей. Однаконедавно группой Блекберн было показано, что при более низких концентрациях теломеразы и меньшей длине теломер в лимфоцитах крови у человека в несколько раз увеличивается риск сердечно-сосудистых заболеваний, которые, как известно, составляют главную причину старческой смертности. Было показано, что у людей, находящихся под воздействием длительного стресса, теломеры укорачиваются гораздо быстрее, чем у их ровесников, находящихся в обычной ситуации. Длина теломер у женщин, испытывающих длительный хронический стресс, эквивалентна их длине у тех, кто на 10 лет старше, но ведет нормальную жизнь. В данный момент проводятся исследования длины и активности теломер у людей с различными заболеваниями, которые являются основными причинами смерти. Главная задача Блэкберн и ее лаборатории — понять, как теломеры ведут себя в организме живого человека, какова их роль на молекулярном, клеточном, организменном уровне. Она перекинула «мостик» от клетки к человеку, из лаборатории в клинику, и сейчас исследует молекулярные механизмы старения и продолжительности жизни на уровне организма.