Молекулярная биология

Лаборатория под руководством де Ланге открыла теломер-специфичный протеиновый комплекс, названный шелтерином (shelterin) и показала, что этот комплекс защищает двуцепочечные концы хромосом. Без шелтерина концы хромосом идентифицируются как двуцепочечные разрывы и эти «повреждения» репарируются. Проведенные в лаборатории Титии де Ланге работы по изучению белков TRF1 и TRF2 показали, что снижение уровня экспрессии теломер-связывающего белка TRF1, способно удлинять теломеры в теломераза-позитивных клеточных линиях при использовании интерферирующих РНК для ингибирования экспрессии белка TRF1 в культуре клеток. Этот подход может применяться для удлинения теломер, не используя повышенную экспрессию теломеразы. Однако данная работа ориентирована пока на клетки иммунной системы. В лаборатории также продолжается работа по изучению белков шелтерина. Ученые хотят выяснить, каким образом концы хромосом защищаются от «репарации». Ответ на этот вопрос прольёт свет на механизм ответа клетки на повреждения ДНК. Возможно, что с помощью данного механизма возможно увеличить продолжительность жизни клетки без риска неоплазии.

Группа профессора Лайтаулерса изучает причины нарушения функционирования митохондрий на молекулярном уровне. Конечной целью исследований является установление ключевых механизмов экспрессии митохондриальных генов через использование трансфекции. Пептидо-нуклеиновые кислоты (PNAs) представляют собой искусственно полученные полинуклеотиды, которые связываются с ДНК и РНК с высокой афинностью и специфичностью. Связываясь с мутантной ДНК митохондрий, PNA блокируют репликацию мутантной ДНК, не затрагивая репликацию ДНК дикого типа. Условием успешной генной терапии является захват и транспорт таких молекул внутрь клеток. В настоящее время эти механизмы остаются малоизученными. В лаборатории профессора Лайтаулерса при использовании конфокальной микроскопии был изучен захват пептидо-нуклеиновой кислоты, меченой биотином, культуральными клетками. Установлено, что после проникновения в клетку PNAs локализуются в цитозоле и ядре. При конъюгации PNAs с лидерным пептидом (пресиквенсом) субъединицы VIII цитохром оксидазы С человека, кодируемая ядерным геномом, показана способность пептидо-нуклеиновой кислоты, меченой биотином, проникать в изолированные митохондрии. Из-за трудностей, связанных с трансфекцией митохон- дрий, в настоящее время уже разработаны альтернативные подходы, применяемые в культуре клеток, для экспрессии митохондриальных генов в ядре клеток того же вида (аллотипическая экспрессия) и в ядре клеток другого вида (ксенотипическая экспрессия).

Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее известным заболеванием с формированием классических амилоидных отложений. Мутации ответственны за развитие заболевания в 2% случаев, тогда как причина развития спорадических форм не совсем понятна. Данные, полученные нейропатологами и генетиками, свидетельствуют, что при этом происходит потеря многофункционального рецептора LR11(нейронального рецептора аполипопротеина Е), также известного как SORLA и SORL1. Ранее было обнаружено, что мыши, мутантные по LR11 (c недостаточным синтезом этого рецептора), показывают тенденцию к повышению экспрессии бета-амилоида в головном мозге. В данном исследовании мыши с дефицитом LR11 были скрещены с трансгенными мышами, экспрессирующими человеческие гены, ответственные за развитие болезни Альцгеймера — пресенилин (presenilin-1) и белок-предшественник амилоида (APP). Джеймс Ла с коллегами показали, что дефицит LR11 значительно увеличивает уровень бета-амилоида и усугубляет раннюю патологию в этой модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей, вызывая ускорение в ее развитии, зависимое от дозы гена LR11. Потеря этого рецептора повышает скорость накопления продуктов метаболизма АPP. Авторы предположили, что рецептор LR11 регулирует процессинг и накопление бета-амилоида in vivo, а также то, что он важен для запуска патологического каскада реакций образования амилоида. Исследования на клеточном уровне позволяют предположить, что LR11 снижает образование бета-амилоидных отложений. Поэтому контроль над экспрессией рецептора LR11 может оказывать очень важное влияние на предрасположенность к развитию болезни Альцгеймера у человека.

В группе доктора Куэрво основное внимание уделяется белку LAMP-A. Этот белок является рецептором лизосом и способствует шаперон-зависимой аутофагии. С возрастом количество этого рецептора падает и, следовательно, эффективность шаперон-зависимой аутофагии снижается, а в цитоплазме клеток накапливается мусор — дефектные белки. В результате работ доктора Куэрво было показано, что введение 22-месячным мышам (этот возраст соответствует 80 годам для человека) рецептора LAMP2Aуменьшает количество дефектных белков в клетках и восстанавливает деятельность органов мышей. Таким образом, ученым удалось в буквальном смысле слова «омолодить» печень. Доктор Куэрво надеется, что ее открытие поможет создать препарат, который поможет справиться с уменьшением рецептора LAMP-2Aс возрастом и предотвратить или по крайней мере облегчить ход различных заболеваний, связанных со старением. Дальнейшей целью работы доктора Куэрво является создание лекарственных препаратов, которые помогут приостановить старение органов человека.

Генистеин — изофлавоноид, входящий в состав сои, может иметь важное значение для профилактики распространения рака простаты. Предыдущие исследования показали, проинвазивный путь, известный как p38 митоген-активированная протеинкиназа (MAPK), стимулирует экспрессию матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2) и клеточную инвазию. MMP-2 была обнаружена в высоких концентрациях в ткани инвазивного рака простаты. Используя шесть линий клеток рака простаты, Ли Ксю (Li Xu) и Раймонд С. Берган (Raymond C. Bergan) установили, что генистеин связывается с активным сайтом белка, известного как митоген-активированная протеинкиназа-4 (MEK4). А сврхэкспрессия MEK4 увеличивает экспрессию MMP-2 и инвазию клеток всех линий. Ферментный анализ подтвердил ингибирование активности MEK4 генистеином. В рандомизированном исследовании 24-х пациентов с раком простаты у тех, кто подвергался воздействию генистеина, были обнаружены пониженные уровни MMP-2 в нормальных эпителиальных клетках предстательной железы. Таким образом, впервые было показано, что терапия генистеином связана со снижением уровня MMP-2 в нормальных клетках простаты, содержащих поражённые раком ткани.

р53 — это хорошо изученный белок-онкосупрессор, который может запускать апоптоз как путем индукции транскрипции проапоптотических генов, так и напрямую влияя на митохондриальную мембрану. Примерно 50% случаев рака у человека связано с генетической или эпигенетической инактивацией p53. По-этому одной из задач исследования была попытка оценки взаимовлияния химиотерапии и сигнальных путей белка р53. Другой задачей было изучение участия р53 в развитии иммунодефицита человека. Недавно было обнаружено, что кроме канцерогенеза, р53, по всей видимости, играет ключевую роль в разрушении иммунной системы вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). У носителей ВИЧ суперэкспрессированы некоторые гены-мишени р53 (например, PUMA — член проапоптотического семейства Bcl-2, а в экспериментах in vitro было показано, что p53 и PUMA лимитируют скорость индукции клеточной смерти от ВИЧ инфекции. Это было продемонстрировано на нескольких модельных системах, в том числе, при изучении вызванного геном Env апоптоза синцития и смерти клетки, индуцированной его продуктом — белком gp120. Исходя из этого, p53 можно рассматривать как новую мишень для терапии ВИЧ.

Особое внимание ученые обращали на изучение коллагеназ (MMP-1, -8 и -13), и других ферментов, которые разрушают фибриллярный коллаген. Также целью исследования была идентификация протеиназ, которые инициируют каскадный механизм активации матриксных металлопротеиназ. В ходе исследования на человеческой артритической ткани было обнаружено, что онкостатин М (OSM) + интерлейкин-1 (IL-1) совершенно точно стимулировали выделение коллагена из хряща — это ключевой момент в процессе разрушения хрящевой ткани. MMP-1, -3, -8 и -13 регулируются цитокином в сочетании с веществами семейства ADAM (дисинтегрин и металлопротеиназы). Была показана важность активации коллагеназ в процессе хрящевого коллагенового синтеза и его блокирование фурином и др. сериновыми протеиназами, ингибирующими подобную активацию. В планах ученых — исследовать роль связок гликопротеина-39, идентифицировать протеиназы, обнаруженные на поверхности клеток, открыть новые каскадные механизмы активизации MMPs, механизмы коллагенолиза, открыть новые субстраты для коллагеназ и эффект лекарств на метаболизм хряща. Таким образом, был открыт механизм коллагенового распада, понимание которого позволит разработать новые терапевтические меры предотвращения разрушения суставов при артрите.

Матриксные металлопротеиназы (ММП), а также их тканевые ингибиторы (TIMP) играют важную роль в процессах опухолевого роста, ангиогенеза, инвазии, метастазирования и в значительной степени определяют злокачественность опухоли. В лаборатории Татьяны Короленко для изучения фагоцитарной функции опухоль-ассоциированных макрофагов, а также уровня ММР/ TIMP -1 при опухолевом росте и метастазировании использовались мыши с трансплантированной аденокарциномой легких Льюис, метастазирующей в легкие. Для получения модели макрофагальной депрессии в печени, легких и опухоли мышам однократно вводили хлорид гадолиния (ХГД).В ходе исследования было показано, что поглощение ХГД клетками печени интактных мышей не влияло на концентрацию TIMP -1 в сыворотке крови и на активность ММП печени. Общая активность ММП была минимальна в опухолевой ткани и снижалась по мере роста опухоли. Формирование метастазов в легких сопровождалось снижением активности ММП в легочной ткани. Рост опухоли сопровождался увеличением концентрации сывороточного TIMP -1, но в меньшей степени по сравнению с мышами, получавшими ХГД. Развитие метастазов индуцировало снижение активности ММП в легких, ХГД не оказывал влияния на это процесс. Таким образом, важную роль в процессе опухолевого роста и метастазирования играет снижение функциональной активности ММP-2 вследствие увеличения экспрессии ее ингибитора TIMP-1.

Одним из симптомов болезни Альцгеймера является накопление полипептида A-бета42, продукта протеолиза белка-предшественника бета-амилоида. При этом у ученых не было точного понимания, какие именно гены и метаболические пути вовлечены в развитие обусловленной A-бета42 нейродегенерации. Для решения этой проблемы научные группы Консолаки и Шедла использовали дрозофилы как модель для изучения молекулярной симптоматики болезни Альцгеймера. В эксперименте экспрессируемый человеческий полипептид A-бета42 вызывал гибель клеток и общую деградацию ткани глаза мухи. При этом ученые обратили внимание на ген TolI (TI), который колирует рецептор регуляторного Tl-NFkB врожденного иммунного/воспалительного пути и является гомологом рецептора интерлейкина I (Ilk-1) млекопитающих. Оказалось, что мутации, ведущие к потере этим рецептором функциональной активности, существенно подавляют тканедегенеративный эффект A-бета42 и наоборот, мутации, усиливающие активность рецептора, способствуют ускорению развития болезни Альцгеймера. Более того, ученые выяснили, что и последующие компоненты Tl-NFkB цепи также непосредственно влияют на тканедегенеративную активность A-бета42. Генетическое манипулирование с элементами этой цепи позволяет непосредственно влиять на процесс клеточной гибели в глазе мухи. Известно, что у больных болезнью Альцгеймера в мозгу в значительной мере разбалансирован врожденный иммунитет по пути Ilk-1-NFkB. Возможно, коррекция Ilk-1-NFkB системы может иметь значимый терапевтический эффект при лече-нии болезни Альцгеймера и некоторых других возраст-зависимых заболеваний.

Отдел Давида Киплинга изучает механизмы репликативного старения клеток человека, раковые заболевания, а также синдром Вернера, который представляет собой состояние преждевременного старения организма с предрасположенностью к раку. Основным методом изучения является использование биочипов. Фибробласты организма человека, страдающего синдромом Вернера, обладают повышенной способностью к росту и продолжительностью жизни после обработки ингибитором SB203580, который подавляет стресс-киназу p38, ответственную за нестабильность генетического материала. Биохимический механизм с экспрессией стресс-киназы p38 приводит к остановке деления клетки. Некоторые ингибиторы р38 уже проходят клинические испытания, а результаты работы группы Давида Киплинга открыли возможный механизм для медикаментозного вмешательства. Полученные данные свидетельствуют об эффективности использования ингибитора SB203580 для лечения преждевременного патологического старения.