Биомедицина

Научной группой Рудольфа Джениша в 2007 году был проведен эксперимент, схожий с опытом Яманака: на основе фибробластов были получены iPS с помощью ретровирусного введения Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc. Было доказано, что профиль экспрессии, метилирования и состояние хроматина iPS аналогичны таковым у эмбриональных стволовых клеток. На основе iPS впервые были получены жизнеспособные химеры. В эксперименте были использованы мыши, чьи гены, кодирующие глобины, были заменены на человеческие гены, несущие мутации. У таких мышей развивалась серповидно-клеточная анемия. На основе полученных из больных мышей фибробластов были сделаны iPS, в которые добавляли «здоровые гены». Затем iPS вводили обратно больным мышам, после чего их состояние улучшалось за счет формирования миелоидных клеток из iPS. iPS могут найти применение в области лечения нейродегенеративных заболеваний, что подтверждается экспериментами по лечению болезни Паркинскона на мышиной модели заболевания. iPS, полученные на основе фибробластов с помощью введения Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc, вводили в мозг эмбриона мыши. iPS мигрировали в различные участки мозга и дифференцировались в разные типы клеток: глиальные клетки, нейроны, включая глутаматэргические, GABA-эргические и катехоламинэргические. Морфологический анализ и электрофизиологические исследования подтвердили, что привитые клетки полностью интегрировались в мозг. Удалось добиться улучшения состояния мыши с болезнь Паркинсона, которой были трансплантированы iPS, дифференцированные в допаминэргические нейроны. Об экспериментах на людях еще говорить рано, однако, перспективы использования iPS многообещающи: из фибробластов больных идиопатической формой болезни Паркинсона были получены допаминэргические нейроны. В 2008 году была разработана более эффективная и безопасная с точки зрения развития опухолей система получения iPS. Было предложено инфицировать фибробласты лентивирусами, несущими dox-индуцируемые факторы перепрограммирования. Эффективность такой системы оказалась в 25–50 раз выше, чем у ранее предложенной методики. На примере мышиной модели серповидно-клеточной анемии была впервые продемонстрирована возможность лечения генетических дефектов c помощью iPS. В будущем, возможно, удастся обойтись без доставки генов в соматические клетки для перепрограммирования. В частности, в результате скрининга различных химических соединений, было найдено вещество, аналогичное по воздействию Klf4.

Адаптация метаболизма к изменениям окружающей среды имеет решающие значение, определяя продолжительность жизни организма. Таким образом, механизмы сигналлинга, регулирующие эту адаптацию будут влиять на процессы старения. Одной из таких сигнальных молекул является инсулин/ инсулиноподобный фактор роста (IGF), являющийся центральным регулятором обмена веществ в многоклеточных организмах. Недавние исследования выявили, что стресс-устойчивый Jun-N-терминальный конец киназы (JNK) является как бы промежуточным пунктом в процессе IGF сигналлинга, обеспечивая связь между окружающей средой и регуляцией метаболизма у дрозофил. Интересно, что подобное взаимодействие ученые отмечали также в центре возрастных метаболических заболеваний. Исследования профессора Хенрика Джаспера сосредоточены на передаче сигнала в клетке в качестве ответной реакции на стресс, обмен веществ и старение. В настоящее время основное внимание в лаборатории уделяется механизму взаимодействия JNK-киназ с инсулином. JNK ингибирует активность IGF и способствует увеличению продолжительности жизни и обеспечивает стрессоустойчивость.

Особый интерес вызывает влияние ферментов репарации на ретротранспозицию. В лаборатории Прескотта Дейнингера на основе модели транспозиции LINE-1 или L1 (Long Interspersed Element-1) мобильного элемента в клетках человека и мышей, было установлено, что возможным промежуточным продуктом ретротранспозиции является ампликон ДНК (a flap intermediate), гетерологичный мРНК матрице, с которой происходило считывание. Для изучения влияния этого интермедиата был охарактеризован гетеродимер ERCC1/XPF во время LINE-1 ретротранспозиции, который, возможно, восстанавливает интактность исходной ДНК матрицы. Снижение количества белка XPF в клетках человека повышало уровень ретротранспозиции, тогда как снижение ERCC1 в клетках хомяка — уменьшало. Профессором Дейнингером впервые было показано, что ферменты, участвующие в репарации ДНК, ингибируют ретротранспозицю мобильных элементов, представленных не длинными концевыми повторами (non-length terminal repeat retrotransposition), к которым относится LINE-1. Таким образом, установлено, что белковый комплекс ERCC1/XPF ограничивает ретротранспозицию мобильных элементов.

В настоящее время группой доктора Магалхаса ведется несколько проектов по следующим темам:1) эволюционная и сравнительная геномика — попытка найти ответственные за старение/долгожительство гены и построение модели эволюции таких генных комплексов и путей их конвергенции/дивергенции при видообразовании.2) клеточные модели и стволовые клетки — обнаружение маркеров долгожительства на клеточном уровне с использованием технологии short hairpin RNA (РНК с короткой петлей, shRNA), аналогичной RNA interference (RNAi), для выключения экспрессии отдельных генов анализа полученных изменений фенотипа.3) системная биология старения — создание базы данных, содержащей максимально исчерпывающую информацию по генетике старения GenAge database, включая собственно профили экспрессии разных генов, белок-белковых взаимодействий, фенотипических данных, а также разработку математических методов для моделирования старения. 4) биология долгоживущих животных — изучение биологии голого землекопа Heterocephalus glaber.5) теоретическая биология старения — сопоставление и объединение полученных данных для выработки единой теории причин возникновения феномена старения в эволюции живых организмов. Анализ и сравнение профилей экспрессии возраст-зависимых генов человека, мыши и крысы указывают на потенциальные мишени для модулирующего воздействия при лечении возраст-зависимых заболеваний.

Доктор Валейо из Университета Питтсбурга показал, что контроль уровня инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) в тимусе может быть одним из способов поддержания иммунного гомеостаза в течение постнатального периода и старения. Доступность в ткани IGF-1 регулируется ассоциированным с беременностью плазменным белком, А (PAPPA). Гомозиготная делеция этого белка приводит к продлению жизни мышей. В лаборатории Абби де Валлейо были получена линия мышей с выключенным геном PAPPA. Уровень IGF-1 в этих генетически-изменённых животных оказался низким, что отразилось на их росте, развитии и нормальной жизнедеятельности. Эти эксперименты позволили сделать вывод о том, что нормальное функционирование IGF-1 напрямую зависит от уровня PAPPA у млекопитающих, данных, которые позже были подтверждены для людей.

Проводимые под руководством доктора Данна исследования сосредоточены на комплексном изучении молекулярных основ аутофагии с использованием методов генетики, клеточной и молекулярной биологии для установления роли отдельных белков. Некоторые полученные доктором Данном результаты представляются достаточно интересными для понимания функционирования аппарата шаперон-зависимой аутофагии. Одним из белков, чье количество в клетке контролируется шаперон-зависимой аутофагией, является альдолаза В. Это гликолитический фермент, в норме находящийся в цитоплазме клетки. Известно, что в условиях голодания этот белок активно транспортируется в лизосомы, где подвергается расщеплению. Такой путь утилизации альдолазы В может быть подавлен 3-метиладени-ном — ингибитором аутофагии. В самой альдолазе В выявлено три мотива (фрагмента), способных стать мишенью для узнавания сигнального пентапептида hsc70: Q12KKEL, Q58FREL, и IKLDQ111. При замене остатков глутамина в указанных последовательностях на остатки аспарагина обнаруживается, что в случае первых двух мутантов ускорение деградации альдолазы В сохранялось на естественном уровне, тогда как в случае третьего мутанта происходило полное подавление деградации альдолазы. Данный пример говорит о том, что, во-первых, мы можем оценить относительную значимость разных аминокислотных остатков для узнавания сигнального пентапептида hsc70, и во-вторых, некоторые участки могут присутствовать в последовательности белка более чем однократно, хоть и не все могут быть функционально активны. Регуляторные механизмы, определяющие функционирование белкового аппарата шаперон-зависимой аутофагии, демонстрируют достаточную степень вариабельности в зависимости от структурной организации вовлеченных молекул. Это позволяет с большей эффективностью реагировать на внешние воздействия и изменения.внутриклеточного гомеостаза.

Работа группы доктора Дайса направлена на изучение шаперон-зависимой аутофагии с учетом всех возможных вовлеченных в нее компонентов и субстратов. В настоящее время считается, что ключевым компонентом аппарата шаперон-зависимой аутофагии (ШЗА) является LAMP2A. Наибольшее количество патологий, связанных с ШЗА, обусловлено снижением его функциональной активности либо из-за его недостатка либо из-за блокирования его активности каким-либо другим фактором. Под контролем ШЗА находится достаточно разнородный набор цитозольных белков. Нарушения функциональной активности ШЗА в процессе старения в клетках печени и в фибробластах объясняется заметным снижением количества LAMP2A в мембране лизосомы. Приняо считать, что причиной этого является изменение свойств лизосомальной мембраны с возрастом. В норме внутри лизосомы содержится достаточное количество молекул LAMP2A, способных повторно связываться с мембраной и участвовать в ШЗА. Потеря этой способности, по-видимому, обусловлена связыванием большей части пула этого белка другими белками в их окисленной форме. Знание модели специфической системы деградации белков в клетке позволяет судить о способе контроля ШЗА над внутриклеточным гомеостазом и адекватно реагировать на изменения внешних условий. На основании коррекции работы этой системы возможно лечение многих возникающих с возрастом заболеваний.

Астроциты управляют ростом нейронов и синапсов с помощью нейроактивных белков и пептидов, также они регулируют состав внеклеточного матрикса. Исследования группы Марины Гюзетти показали, что стимуляция мускариновых рецепторов астроцитов индуцирует прорастание нейронов в культуре клеток гиппокампа, а этанол тормозит этот процесс. Известно, что астроциты производят факторы, стимулирующие или ингибирующие нейрогенез. Однако, механизм, контролирующий производство этих факторов, недостаточно изучен. Астроциты экспрессируют мускариновые рецепторы, активация которых вызывает мощную внутриклеточную сигнализацию. Работа группы Марины Гюззетти посвящена исследованию вопроса: смодулирует ли стимуляция мускариновых рецепторов астроцитов нейрогенез в гиппокампе. Крысиные нейроны гиппокампа культурировались вместе с крысиными контикальными астроцитами, предварительно обработанными холинэргическим агонистом — карбахолином. Действие карбахолина на астроциты приводило к активации М3 мускариновых рецепторов, что увеличило экспрессию внеклеточных матричных белков фибронектина и ламинина-1 в этих клетках. Этот эффект был опосредован, во-первых, возрастанием уровней ламинин-1 и фибронектиновых мРНК и во-вторых, повышающей регуляцией продукции и выброса ингибитора протеолитической деградации внеклеточного матрикса. Ингибирование фибронектиновой активности сильно уменьшает эффект карбахолина — удлинение всех нейронов, вместе с тем ингибирование активности ламинина-1 уменьшает удлинение только меньшинства нейронов. Ингибитор активатора фибриногена также вызвал удлинение нейронов через прямое влияние на них. Обобщив результаты этой работы, можно сделать вывод о том, что холинэргическая стимуляция астроцитов индуцирует производство факторов, усиливающих нейрогенез.

В 90-е годы ХХ века Фред Гейдж с коллегами получил доказательства нейрогенеза в мозге взрослого человека, его группе также принадлежат открытия ряда механизмов дифференцировки нервных клеток. Ученые этой группы показали, что на выживаемость новых нейронов в мозге критически влияет сигнализация от окружающих клеток. При угнетении глутаматных рецепторов (посредников передачи сигнала) новых нейронов, наблюдается их гибель. Эта же группа ученых открыла, что вклад в формирование индивидуальных особенностей нейронов могут вносить случайные перемещения мобильных генетических элементов, или «прыгающих генов». Исследователи изучали поведение мобильных генетических элементов LINE-1 (L1) в клетках экспериментальных животных. Большинство L1 утратило способность к перемещениям, но некоторое количество генов, перемещается по геному. Скачки LINE-1 в нейронах оказались приуроченными к местам расположения активных генов. Было высказано предположение о том, что эти мобильные элементы могут напрямую влиять на работу генов и вносить вклад в создание функционального разнообразия нервных клеток. В настоящее время, одним из наиболее важных направлений исследований группы является разработка способов «репрограмирования» собственных соматических клеток организма в плюрипотентные стволовые, без использования виральных агентов. Эти снижает риск иммунного отторжения, более того, эти клетки применимы для исследования сложных болезней с наследуемыми и случайными мутациями. Стратегии эписомального перепрограммирования представляют собой безопасный способ производства человеческих плюрипотентных клеток (induced pluripotent stem cells or iPSCs) для клинических целей и фундаментальных исследований.

Доктор Гуаренте и его коллеги занимаются изучением роли гистоновой деацетилазы Sir2 в старении и продолжительности жизни. Показано, что делеция SIR2 укорачивает жизненный цикл, а дополнительная копия этого гена, наоборот, продлевает жизнь. Кроме того, активность гена Sir2 также отвечает за саленсинг, что в свою очередь связано с процессами старения. Ученые говорят о возможности контроля Sir2 с помощью NAD, так как Sir2 относится к NAD-зависимым деацетилазам. Эта регуляция определяет связь между потреблением калорий и скоростью старения, о которой говорят многие ученые, занимающиеся проблемами старения.