Биомедицина

Основная тема исследований лаборатории Ома Сриваставы — изучение роли сшивок и агрегации фрагментов белка кристаллина при старении и развитии катаракты. Кристаллин — общее название семейства белков, входящих в состав хрусталика и роговицы глаза человека и других млекопитающих. Криталлин состоит из нескольких индивидуальных белков: αА- и αВ- кристаллины — белки-шапероны, поддерживающие структуру белков хрусталика и, следовательно, его прозрачность; γ-кристаллин — структурный белок хрусталика. Цель исследования заключалась в том, чтобы определить in vitro сшивки гамма-D-кристаллиновых фрагментов между собой и с альфа-, бета- и гамма-кристаллинами. Также ученые попытались выяснить существование ковалентных мультимеров полипептидов in vivo, и посттрансляционных модификаций трех изоформ полипептида. Результаты исследований показали, что фрагменты кристаллина сшиваются ковалентно, но без участия дисульфидных мостиков. Сшивки возникают, как между гамма-D-фрагментами, так и с альфа-, бета и гамма-кристаллинами. К посттрансляционным модификациям полипептида кристаллина относится окисление триптофана и метионина. Значит, гамма-D-кристаллиновый фрагмент способен сшивать другие фрагменты и способствует окислению метиониновых о триптофановых остатков. В ходе исследования ученые также обнаружили 2 типа мультимеров, появляющихся в молодом возрасте и продолжающих накапливаться с возрастом. Первый тип состоит из восьми различных кристаллинов (альфа, А, альфа В и т. д.). Второй тип кроме кристаллинов содержит белки филенсин и факинин. Фрагменты кристаллинов подвергаются посттрансляционным модификациям. При развитии катаракты обнаружено более интенсивное накопление мультимеров, чем у здоровых людей. У пациентов с диагнозом катаракта обнаружены нерастворимые фрагменты кристаллинов — бетаA3/A1 и бетаB1. Дальнейшее изучение различных типов белка кристаллина и его модификаций в хрусталике глаза необходимо для разработки методов лечения катаракты.

Для старых животных ограничение калорийности считалось менее эффективным средством постепенного замедления или предотвращения возрастных изменений в экспрессии генов. Однако профессор Спиндлер с коллегами обнаружили, что мыши, которым ограничили калории в конце среднего возраста, почти сразу испытали преимущества этой диеты. Ограничение калорийности, начатое в конце жизни, позволило увеличить срок жизни мышей на шесть месяцев, и обусловило задержку смерти от рака, возможно, за счет снижения темпов роста опухоли. При восстановлении обычного режима питания животные быстро вернулись на свои предыдущие модели экспрессии генов. Поскольку рак печени является наиболее распространенной причиной смерти этих мышей, результаты указывают на причинно-следственную связь между количеством потребляемых калорий, темпами старения и моделью экспрессии генов печени. Ни одно из предыдущих исследований на млекопитающих не связывало так тесно эти явления. Группа профессор Спиндлера также провела исследования экспрессии генов на мышах с нарушениями передачи сигнала инсулин-подобного фактора роста-1 (IGF). Эти мыши либо получали диету с ограничением калорийности (ОК), либо питались свободно. Эксперименты показали, что ОК и IGF аддитивно действуют на экспрессию группы генов, связанных с повышенной долговечностью. Это гены, связанные с увеличением чувствительности к инсулину, глюкагону и катехоламинам, глюконеогенезу, обороту белка, бета-окислению липидов, апоптозу, метаболизму ксенобиотиков и окислителей; уменьшению пролиферации клеток, синтеза липидов и холестерина, а также экспрессии шаперонов. В исследовании, проведенном Спиндлером, изучалось изменение паттерна экспрессии тех или иных генов, в ответ на различные вещества, претендующие на роль миметиков ограничения калорийности. В частности — исследовались мелатонин, альфа-липоевая кислота, аминогуанидин, коэнзим-Q и метформин. Исследование производилось с помощью ДНК-микрочипов (DNA microarray). Подопытные мыши получали упомянутые миметики ограничения калорийности в течение 8 недель. Кроме того, группа профессора Спиндлера исследовала влияние низкокалорийной диеты на сердце мыши. У мышей, переведенных на низко-калорийную диету в конце жизни, работала та же модель экспрессии генов печени, как и у мышей, которым калорийность питания ограничили в раннем возрасте. Эти исследования определили целевую группу новых генов, которые могут быть мишенью терапевтических средств, оказывающих влияние на старение, а также препаратов для лечения связанного со старением ожирения.

Гипоактивность является фактором старения, а скорость укорочения теломер — показателем старения, поэтому сотрудники лаборатории под руководством Спектора проверили гипотезу, что физическая активность вне рабочего времени (за 12 месяцев) связана с длиной теломер в лейкоцитах здоровых людей. Было исследовано 2401 белокожих близнецов, из них 2152 женщины, и 249 — мужчины. Ученые установили, что длина теломер была прямо связана с физической активностью после поправок на возраст, пол, вес, курение, социоэкономический статус и физическую активность на работе. Теломеры у наиболее активных была на 200 п.н. длиннее, чем у наименее активных. Таким образом, сидячий образ жизни в совокупности с курением, избыточным весом и социоэкономическим статусом влияет на длину теломер и продолжительность жизни. Кроме того, ученые исследовали 1122 женщин европеоидной расы в возрасте 18–76 лет и выяснили, что длина теломер стабильно уменьша-лась с возрастом с частотой 27 пар нуклеотидов (п.н.) в год. Теломеры женщин, страдающих ожирением, были на 240 п.н. короче, чем у стройных. Была установлена следую-щая зависимость, что одна пачка сигарет в год укорачивала теломеры дополнительно на 5 п.н. Таким образом для предотвращения старения клеток важно поддерживать организм в тонусе с помощью физических упражнений и вести здоровый образ жизни.

С момента расшифровки роли малых РНК в практически всех жизненных клеточных процессах, многие ведущие лаборатории направили свою научную деятельность на изучение микроРНК в функционировании стволовых клеток. Важной находкой лаборатории Слэка стало идентификация целого ряда микроРНК, экспрессия которых является «маркерной» для стволовых клеток. Прорывной можно считать работу, в которой лаборатория Слэка описывает микроРНК lin-4 и ген её регуляции — транскрипционный факторlin-14. Эта микроРНК ответственна за продолжительность жизни червя C. elegans. Оказалось, что эта зависимость наблюдается и у человека. Ингибирование микроРНК lin-4 приводит к повышенной экспресси белка lin-14, что укорачивает продолжительность жизни клеток нематоды и убыстряет старение тканей. И наоборот, повышение экспрессии lin-4 влечёт за собой снижение экспрессии белка lin-14 и, как следствие, увеличивается продолжительность жизни.

Ген белка муколипин-1 был клонирован в 2000 году в лаборатории доктора Слаугенгаупт. Впоследствии было показано, что этот белок играет большую роль в перемещении кальция через лизосомальную мембрану. С мутацией в гене этого белка связано одно из расстройств работы лизосом — муколипидоз IV типа (MLIV), приводящее к потере TRPML1 из мембраны лизосомы и в конечном итоге к гибели клетки. Данные экспериментов показали, что TRPML1, TRPML2 и TRPML3, вместе составляющие субсемейство муколипинов, могут образовывать агрегаты на поверхности лизосомы, способные аккумулировать на себе значительное количество шаперонов СМА. В лаборатории было проведено сравнение фибробластов людей с синдромом муколипидоза IV типа (MLIV) и без него. Оказалось, что в лизомальной мембране фибробластов MLIV снижено количество LAMP2A, что естественным образом ведет к снижению функции СМА и накоплению в клетке белков с нарушенной третичной структурой и окисленных белков. Аппарат шаперон-зависимой аутофагии находится в тесной взаимосвязи с остальными системами клетки и эффективность его функционирования может модулироваться другими, еще неучтенными, факторами.

Одной из многочисленных причин старения, является накопление активных форм кислорода (ROS), и наибольшая их концентрация наблюдается в митохондриях — энергетических системах клетки. Одним из направлений работ Владимира Скулачева является разработка новых геропротекторов — митохондриальных антиоксидантов. Наиболее известным являются вещество SkQ1, сконструированное и синтезированное на основе пластохинона — вещества хлоропластов. На сердечных митохондриях in vitro было показано, что SkQ1 может восстанавливаться дыхательной цепью, то есть служить возобновляемым антиоксидантом многократного действия. Результаты исследований показали, что SkQ1 способен тормозить апоптоз клеток HeLa и фибробластов человека, вызванный Н2О2, увеличивать медианную продолжительность жизни у грибов Podospora anserina, рачков Ceriodaphnia affinis, дрозофил, а у мышей — до двух раз. На мышах и крысах было показано, что SkQ1 замедляет развитие таких признаков старения, как инволюция тимуса и фолликулярных клеток селезенки, уменьшение соотношения лимфоцитов и нейтрофилов в крови, остеопороз, катаракта, ретинопатия, глаукома, облысение, поседение, исчезновение эстральных циклов у самок и полового влечения у самцов и гипотермия. SkQ1 — это эффективный антиоксидант. Его задача — удаление из митохондрий избытка АФК, возникающих в процессе старения. Исследователи пришли к выводу, что антиоксидант SkQ1 снижает смертность на ранних и средних этапах старения и предотвращает появление большой группы старческих дефектов.

Используя данные, полученные на мышах, не продуцирующих остеопонтин (неколлагеновый адгезивный матриксный белок, OPN), и при применении экзогенного остеопонтина, исследователи показали влияние OPN на гематопоэтические стволовые клетки (ГСК). При отсутствии остеопонти-на количество ГСК увеличивалось, поскольку усиливалась экспрессия Jagged1 и ангиопоэтина-1 и, кроме того, уменьшалось количество апоптотических примитивных гемопоэтических клеток. Активация микроокружения стволовых клеток паратиреоидным гормоном уменьшала экспрессию OPN и останавливала увеличение количества стволовых клеток в его отсутствие. Таким образом, остеопонтин негативно регулирует количество гемапоэтических стволовых клеток, и это доказывает ключевую роль остеобластов, как клеток ниши стволовых клеток, в регуляции ГСК.

HSF1 считается главным фактором ответа на стресс, в то время как HSF2, по большей части, отвечает за клеточное развитие. Изучение этих двух транскрипционных факторов теплового шока является абсолютным приоритетом в работе лаборатории Леа Систонен. В ходе одного из исследований ученые обнаружили, что во время теплового стресса факторы HSF1 и HSF2 одновременно находятся на одном и том же участке ДНК.Изначально считалось, что для активации этих факторов необходимо образование гомотримеров, как результат связывания их HR-A/B доменов. Однако, данные гомологичного моделирования, а затем и экспериментальные данные, показали возможность формирования гетеротримеров. Таким образом, стрессовый шок влечет за собой формирование гетеротримеров HSF1 и HSF2 и их последующее взаимодействие с ДНК. Стоит отметить, что в зависимости от характера внешнего или внутреннего стимула формируются разные гетеротримеры. При ответе на тепловой стресс в основном формируются гетеротримеры, состоящие из 2 молекул HSF1 и 1 молекулы HSF2. При клеточном развитии, наоборот, образуются комплексы из 2 молекул HSF2 и 1 молекулы HSF1. Эта фундаментальная работа дала совершенно новое представление о молекулярных механиз-мах работы семейства транскрипционных факторов действия семейства HSFs.

В лаборатории Дэвида Синклэра было показано, что резвератрол имитирует положительный эффект ограничения калорийности питания, без его применения. Исследователи обнаружили, что паттерны (профили) экспрессии генов при воздействии резвератрола и органичительном питании во многом похожи. Более того, мыши, которые получали резвератрол, проявляли меньше признаков старения, включая пониженную альбуминурию, пониженный уровень воспаления, апоптоза клеток сосудистого эндотелия, повышенную эластичность аорты, низкий уровень формирования катаракты и т. д. Это исследование указывает на целый спектр положительных эффектов от применения резвератрола.

AGE (конечные продукты гликирования) способны повреждать клетки различными способами: нарушения функций белков за счет модификации, сшивки белков, индукция образования свободных радикалов, активация иммунного ответа. Накопление AGE продемонстрировано на примере разных тканей у людей, больных диабетом. Более того, исследователи из лаборатории доктора Монниера (Кливленд, США) показали, что накопление AGE может быть использовано как маркер ранней гибели мышей. В то же время обнаружено, что AGE способны накапливаться и у здоровых, но стареющих людей.