Биомедицина

Один из способов повышения трансплантационной толерантности — использование гемопоэтического химеризма, то есть сосуществования в организме гемопоэтических стволовых клеток донора и реципиента. Гемопоэтический химеризм может быть индуцирован у мышей с помощью мягкого, немиелоаблативного кондиционирования с облучением костного мозга и тимуса низкими дозами радиации. Полученные мыши специфично толерантны к антигенам донора и реципиента. Впоследствии в работе Меган Сайкс было показано, что к подобному результату можно прийти, используя большие количества стволовых клеток вместо облучения костного мозга. Трансплантированные после такого лечения стволовые клетки донора будут в течение долгого времени источником клеток-предшественников, дифференцирующихся в клетки, представляющие антиген (АРС). В свою очередь, APC клетки будут участвовать в элиминации реактивных Т-клеток реципиента. Таким образом, будет снижаться риск развития неблагоприятных иммунных реакций при трансплантации. В последнее время явление гемопоэтического химеризма находит применение при лечении злокачественных новообразований клеток крови. Это связано с реакцией «трансплантат против лейкоза» (graft-vs-leukemia/lymphoma, GVL). Противоопухолевое действие GVL-реакции связано с тем, что образующиеся в результате гемопоэтического химеризма «активированные» Т-клетки донора, помимо клеток реципиента элиминируют и опухолевые клетки. Используя специальные протоколы лечения, основанные на «позднем» введении лимфоцитов донора, удалось получить состояние полного химеризма с выраженными GVL-эффектами, но без GVDH-реакций. Облучение тимуса можно заменить коротким курсом лечения реципиента антителами к клеткам CD4 и CD8, что также приведет к временному истощению популяции Т-клеток реципиента. Эти исследования нашли свое применение в клинических протоколах лечения злокачественных лимфоидных новообразований.

Один из научных интересов Барбары Савольдо — разработка методов повышения качества и устойчивости химерных Т-клеток. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), наведенные на невирусные опухолевые антигены, не могут сохраняться долгое время и имеют ограниченную противоопухолевую активность in vivo. В частности, это происходит из-за того, что опухолевые клетки бедны костимуляторными молекулами. Ученые группы Барбары Савольдо разработали ЦТЛ, специфичные к вирусу Эпштэйна-Барра для экспрессии химерных антигенных рецепторов к диалиалоганглиозиду GD2 — антигену, представленному на клетках человеческой нейробластомы. Эти лимфоциты получают оптимальную костимуляцию своих нативных рецепторов, что улучшает их выживаемость и антиопухолевую активность, опосредованную их химерными рецепторами.

Инволюция тимуса, наряду со снижением количества лимфоцитов в периферических тканях, — одна из основных причин возрастного снижения иммунитета. Учеными группы под руководством Вильсона Савино проводится исследование возможности гормональной терапии возрастной инволюции тимуса. Исследования с манипуляцией стероидными половыми гормонами также имеют многообещающие для терапии результаты. Показано увеличение имуннопоэза, вызванного стероидными гормонами в стареющем тимусе, увеличение числа клеток эпителия тимуса. В исследованиях на мышах было показано, что введение гормона роста старым мышам препятствовало дегенерации тимуса и увеличивало производство иммунных клеток.

Основная тема исследований Алексея Рязанова — сигнальные молекулы, синтез белков и их взаимосвязь с клеточным ростом, дифференцировкой и старением. Проверяются уже сертифицированные медицинские препараты. В случае обнаружения веществ, имеющих положительный эффект на продление жизни вещества не нужно будет заново сертифицировать, так как их и так используют в лечебной практике. Данные по исследованию еще не опубликованы. В дальнейшем этот научный проект планируется расширить и провести клинические, паталогоанатомические, гистологические анализы для выявления влияния веществ на развитие рака и болезней, связанных со старением. В настоящий момент под руководством профессора Рязанова проходит масштабный скрининг более тысячи препаратов на эффект продления жизни у мышей.

Группа Роберта Рукера изучает механизмы образования неэнзиматических сшивок в структуре коллагена и эластина. Процесс образования сшивок чувствителен к содержанию меди в организме, т. к. медь является кофактором фермента лизил-оксидазы (катализирует окислительное дезаминирование лизиновых остатков, вовлеченных в формирование сшивок). Ученые исследовали, как различное содержание меди в потребляемой пище влияет на образование сшивок. Они оценивали уровень лизил-оксидазы в тканях мыши. Самые высокие конценрации лизил-оксидазы были обнаружены в соединительной ткани (сухожилия, кожа), средние показатели — в аорте, почках, легких и печени. А самая низкая концентрация была выявлена в тканях скелетной мускулатуры и диафрагмы. Мыши, рацион которых содержал 2 микрограмма/грамм меди, демонстрировали меньшую функциональную активность лизил-оксидазы (в коже), чем мыши, которые получали с пищей по 10 микрограмм/грамм. Однако дефицит меди не влиял на уровень мРНК для лизил-оксидазы. В исследовании подчеркиваются незначительные изменения количества фермента при различных диетах и небольшое снижение функциональной активности при недостатке меди. Темой для дальнейших исследований ученых может стать понимание механизмов образования сшивок в структуре коллагена и эластина, т. к. именно они приводят к старению всех тканей организма, а особенно — кожи и соединительной ткани. Функциональная активность фермента лизил-оксидазы у мышей с дефицитом меди в рационе была снижена на половину или на 2/3 от нормы.

У молодых или взрослых организмов ниши стволовых клеток эффективно замещают утраченные клетки: стволовые клетки выходят из ниш, делятся и дифференцируют. В пожилом возрасте стволовые клетки имеют низкие уровни теломеразы, недостаточные для сохранения стабильности теломер. Поэтому стволовые клетки в старости имеют укороченные теломеры и пониженную мобилизационную активность для эффективной регенерации тканей. Вместе с тем они ускоряют старение из-за низкой мобилизационной активности стволовых клеток и прогрессирующей дегенерации тканей. Стволовые клетки с аномально высокими уровнями теломеразы (это может произойти, например, в результате мутации) мобилизуются более быстро, чем нормальные клетки. В таких условиях обновление ткани происходит быстро, но повышается риск развития рака. В исследованиях профессора Рудольфа используется мышь, дефектная по теломеразе, в качестве модельной системы изучения процесса укорочения и сохранения стабильности хромосом в стволовых клетках. Укорочение теломер значительно сокращает пролиферативный потенциал стволовых клеток взрослого организма. Установлено, что укорочение теломер индуцирует в клетке механизм внутреннего контроля и остановку клеточного цикла (intrinsic checkpoint) , снижающего самообновление и функцию взрослых стволовых клеток. Ингибирование этого механизма (например, делеция локуса Cdkn1/p15INK4b — циклин-зависимого ингибитора киназ, инактивация экзонуклеазы-1) восстанавливало функцию стволовых клеток и продляло жизнь мышей с отсутствием теломеразы. Кроме того, укорочение теломер способствует патологическим изменениям в окружении ниши стволовых клеток и развитию болезней стволовых клеток (гемопоэтическая дисфункция и проч). В Ганновере проф. Рудольф проводил исследования по влиянию укорочения хромосом на регенеративную функцию печени и обнаружил, что укорочение хромосом в гепатоцитах связано с хромосомной нестабильностью и повышенным риском развития рака печени и цирроза печени. Короткие теломеры стволовых клеток препятствуют накоплению ненормальных и модифицированных клеток в здоровой ткани, тем самым снижая онкогенный риск.

Болезнь Хантигтона связана с удлинением полиглутаминового участка гена хантингтина. Эта мутация приводит к образованию продукта с неправильной конформацией, который накапливается в цитоплазме, формируя токсичные для клетки агрегаты. На модельных системах удалось показать, что подавление аутофагии ускоряет образование таких агрегатов, а стимуляция — снижает скорость образования новых агрегатов и способствует разрушению уже существующих. Для стимуляции аутофагии используется рапамицин -ингибитор mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих), который в свою очередь является ключевым ингибитором аутофагии в клетке. В опытах на D. melanogaster было показано, что рапамицин защищает от нейродегенерации. Аналог рапа-мицина, CCI-779, повышал результаты мышей с модельной болезнью Хантигтона в четырех различных поведенческих тестах и снижал количество агрегатов в мозге. В настоящее время рапамицин используется в качестве иммуносупрессанта для предотвращения отторжения органов при пересадке. Наличие у рапамицина иммуносупрессивных свойств, а также побочных эффектов, делает актуальной задачу поиска других препаратов-стимуляторов аутофагии. Таким образом, индукторы аутофагии могут иметь важное терапевтическое значение. В результате тестирования 253 соединений был найден ряд препаратов, индуцирующих аутофагию: антагонисты Ca2+ каналов L-типа (верапа-мил, лоперамид, нимодипин, амиодарон), индуктор K+ATP каналов — миноксидил, активатор Gi сигнального пути — клонидин, и другие.

Задача экспериментальной эволюции — воспроизвести в лабораторных условиях природный эволюционный процесс, заставляя поколения развиваться, производить потомство, адаптированное к стрессовым условиям окружающей среды. Подобный метод может дать бесценный материал для изучения процесса старения. Первая серия экспериментов в этом направлении была реализована Майклом Роузом, ныне — одним из крупнейших специалистов по эволюционной биологии старения. Начиная с 1970-х годов, он проводит эксперименты по увеличению продолжительности жизни в цепочке поколений дрозофил. Искусственно откладывая репродукцию, Роузу удалось создать долгоживущие линии фруктовых мушек, которые были названы Methuselah flies. Затем он провел серию «обратных» экспериментов и создал короткоживущие линии, используя тот же метод. В 1981 году в Университете Галифакса (Канада) он создал лабораторию «эволюционной радиации» («evolutionary radiation» of Drosophila melanogaster populations). Он предлагает следующую стратегию изучения закономерностей процесса старения и влияния на него: создание линий мышей, у которых искусственно задерживается репродукция в течение многих поколений, — что позволит пронаблюдать за эволюционным процессом и получить «у природы» ответ, как именно эволюция создает долгоживущие организмы. Затем — разработка инженерных методов, основанных на результатах этого «эволюционного эксперимента», которые позволят создать анти возрастную терапию для людей. Экспериментальная база для подобного проекта — эксперименты с дрозофилами, которые показали, что по мере смены многих поколений фруктовых мушек, у которых репродукция была искусственно задержана, происходит резкое замедление или даже остановка процесса старения. Все эти исследования в области экспериментальной эволюции создали базу для теоретических выводов о закономерностях процесса старения и возможности повлиять на его ход. В 2007 г. Роуз предложил так называемую «эволюционную версию SENS», согласно которой старение должно интерпретироваться не как накопление повреждений, а как потеря адаптации.

Основной темой исследований доктора Рота является исследование влияния калорической рестрикции на старение у приматов. Кроме того, группа доктор Рота ведет разработку миметиков калорической рестрикции. Первый миметик калорической рестрикции — 2-деоксиглюкоза, открытый более десяти лет назад, при повышенных дозах обладает токсичностью. Джордж Рот и его коллеги обнаружили альтернативу 2-деоксиглюкозе — простой углевод манногептулоза, содержащийся в авокадо, который оказывает действие на те же метаболические пути, что и калорическая рестрикция. Однако он менее токсичен. Мышам вводили до 300 микрограмм этого миметика калорической рестрикции на грамм веса животного. При этом у мышей повышалась чувствительность к инсулину и повышалась скорость выведения глюкозы из крови. Кроме того, манногептулоза увеличивала скорость «сжигания» жиров в мышцах. Мыши, которым была введена манногептулоза, без ограничения питания жили на 30% дольше, чем контрольная группа животных.

Хорошо известно, что эластазы нейтрофилов участвуют в разрушении эластиновых волокон легочной ткани. Матриксные металлопротеиназы MMP8 и MMP9 были найдены в нейтрофилах, которые способны разрушать коллаген и эластин, соответственно. Макрофаги, а не нейтрофилы, в основном входят в состав как здоровой, так и патологической ткани легких. Эти клетки в пораженном участке легкого продуцируют огромное количество металлопротеиназ — желатиназы A (MMP9), мартилизина (MMP7) и металлоэластазы (MMP12), каждая из которых способна разрушать эластин. В нормальных макрофагах MMP12 присутствуют в следовых количествах, в то время как альвеолярные макрофаги курильщиков секретируют большое их количество. MMP12 необходим как для накопления макрофагов, так и для разрушения тканей при эмфиземе в результате длительного вдыхания сигаретного дыма, и матриксные металлопротеиназы также могут быть необходимы для пропускания макрофагов внутрь легких. Трансгенное исследование показало, что при сверхэкспрессии MMP12 у мышей развивается легочная эмфизема.