Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells

Разработчики

Андриана Г. Котини, Ча-Джунг Чанг, Стивен Д. Наймер, Эйрини П. Папапетроу и др.

Описание технологии

Хромосомные делеции, связанные с такими заболеваниями человека, как рак, широко распространены, однако моделирование таких делеций с использованием мышей осложняется синтенией (то есть, структурным сходством групп сцепления генов у организмов разных биологических видов).

Для решения проблемы синтении разработчики данной технологии использовали клеточное перепрограммирование и генную инженерию, при помощи которых производилась функциональная диссекция делеции хромосомы 7q (del(7q)) − соматической цитогенетической аномалии, наблюдающейся при миелодиспластическом синдроме (МДС). Изогенные кариотипически нормальные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) и iPSCs с делецией del(7q) были получены из кроветворных клеток больных МДС и с помощью этих клеток было показано, что iPSCs с делецией del(7q) повторяют связанный с этим заболеванием фенотип, включая нарушения гемопоэтической дифференцировки. Фенотипы болезни были сохранены с помощью спонтанной коррекции дозы гена и могли быть воспроизведены в кариотипически нормальных клетках при помощи сконструированного гемизиготного состояния определенных сегментов chr7q в 20-Мб регионе. Авторы использовали скрининг сохраненных фенотипов для идентификации гаплонедостаточных генов-кандидатов, которые могут опосредовать del(7q)-гематопоэтический дефект.

В целом предлагаемый технологический процесс осуществлялся следующим образом: i) продукция изогенных hPSCs, несущих специфическую делецию; ii) определение фенотипа в соответствующем болезни типе клеток, который был получен из hPSCs; iii) идентификация гаплонедостаточных генов-кандидатов на основе их дифференциальной экспрессии в диплоидном состоянии против гаплоидного состояния и iv) фильтрация их через фенотип-сохраняющий скрининг для того, чтобы выбрать один или несколько кандидатов для последующих исследований.

Такая диссекция фенотипов MDS-iPSC на молекулярном уровне была способна обеспечить понимание патогенеза миелодисплазии и лейкозной трансформации.

Практическое применение

Технология представляет собой стратегию функциональной генетики рака, которая несомненно окажется применимой к изучению связанных с заболеванием хромосомных делеций. Эта стратегия осуществляется как анализ приобретения новой патологической функции (сохранения функции), что обеспечивает значительные преимущества по сравнению со скринингами на основе нокдауна/нокаута. Она представляет собой обобщенный подход к открытию гаплонедостаточных генов. Поскольку ген может быть моноаллельно инактивирован разными способами, этот подход может интегрироваться с данными о мутациях различных классов (вариации числа копий, одиночные нуклеотидные полиморфизмы) из баз данных генома рака для того, чтобы составить информацию о генных приоритетах.

Этот подход подчеркивает полезность человеческих iPSCs как для функционального картирования крупномасштабных хромосомных делеций, связанных с заболеванием, так и для обнаружения гаплонедостаточных генов.

Кроме того, надежность клеточных фенотипов МДС, полученных с помощью этой технологии, может обеспечить платформу для скрининга лекарств на основе этих фенотипов и идентификации малых молекул, которые могут излечить эти патологические фенотипы.

Лаборатории

• Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York (USA)
• The Tisch Cancer Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York (USA)
• The Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York (USA)
• Sylvester Comprehensive Cancer Center, Miller School of Medicine, University of Miami, Miami, Florida, USA.
• Division of Hematology, Department of Medicine, University of Washington, Seattle (USA)
• Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington, Seattle (USA)
• Department of Pathology, University of Washington, Seattle (USA)

Ссылки

Публикации

• Kotini, A.G. et al. «Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells." 33.6 Nat Biotechnol. (2015): 646−655.
• Papapetrou, E.P. et al. «Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells." 29 Nat. Biotechnol. (2011): 73–78.
• Papapetrou, E.P. & Sadelain, M. «Generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells with an excisable single polycistronic vector." 6 Nat. Protoc. (2011): 1251–1273.