Гидрогель с амфифильными пептидами – хорошая основа для 3D-моделирования раковых опухолей
Рис. 1. Схематичное изображение структуры гидрогеля и дизайн эксперимента. Вверху в центре показана структура гидрогеля. Оранжевым показаны клетки опухоли, серым – вспомогательные клетки. Зеленые кружочки – точки прикрепления молекул кератина и пептидных нановолокон. Звездочки – участки пептидов, которые обеспечивают взаимодействие. Синие линии – структуры, состоящие из пептидных нановолокон и белков. Исследователи изучали состав и жесткость полученных гидрогелей, а также их способность к деградации. Внизу – схема эксперимента по выращиванию клеток в гидрогеле из растворов пептидов и белков (кератина и фибронектина). Клетки помещали в раствор пептидов, который затем смешивали с раствором белков. Полученный гидрогель с клетками изучали в течение 1–4 недель, отслеживая взаимодействие клеток друг с другом и внеклеточным матриксом, рост клеток и реакцию на воздействие химиотерапевтических препаратов. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science Advances.
Международная команда исследователей предложила новый подход к трехмерному моделированию раковых опухолей, позволяющий лучше воспроизвести их микроокружение и условия, в которых они растут в организме. В качестве каркаса для клеточной культуры они предложили использовать гидрогель из амфифильных пептидов, собирающихся в длинные и прочные нановолокна, и внеклеточных белков. Эксперименты проводились с клетками рака яичника. Они хорошо прижились в гидрогеле и стали вести себя почти так же, как и в реальной опухоли. Важное преимущество этого подхода со сравнению с предыдущими – состав каркаса можно подбирать в зависимости от опухоли. Ученые надеются, что таким образом удастся получать более физиологичные модели для разных типов рака, что поможет в поиске новых химиотерапевтических препаратов.
Хорошие модели злокачественных опухолей нужны как ученым, которые проводят фундаментальные исследования, так и разработчикам новых противоопухолевых препаратов. Сейчас чаще всего для моделирования опухолей используют традиционные двухмерные культуры клеток: клетки опухоли помещают в пластиковую посуду, где они растут, образуя монослой. Но при этом, помимо объемной структуры, не воссоздаются многие другие важнейшие свойства опухолей и взаимодействия, в которые они вступают в организме. Объемные клеточные культуры получают двумя способами. Можно помешать клеткам прикрепляться к пластику культуральной посуды и создавать монослой. Этого обычно добиваются либо методом «висячей капли» (см. R. Foty, 2011. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids), либо используя посуду из специального пластика. Альтернативный способ – использование каркасов из различных материалов, к которым клетки могут прикрепиться и создать трехмерную структуру. Подробный обзор разных методов культивирования раковых клеток можно найти в статье M. Kapałczyńska et al., 2018. 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures, а мы далее сосредоточимся на «каркасных» методах.
Опухоль состоит не только из злокачественных клеток – в ее состав входят клетки соединительной ткани, эндотелий и иммунные клетки. Все это погружено в секретируемый клетками опухоли внеклеточный матрикс, состоящий в основном из структурных белов (фибронектин, коллаген, кератин) и пептидогликанов (например, гиалуроновой кислоты). Внеклеточный матрикс механически поддерживает клетки и обеспечивает транспорт веществ между ними. Эту совокупность называют микроокружением опухоли. И если присутствие других видов клеток в модели можно обеспечить совместным культивированием, то имитировать все их взаимодействия in vitro практически невозможно. Решением этой проблемы является использование методов трехмерного культивирования, позволяющего воссоздать структуру и реальное взаимодействие между клетками.
Опухоль и ее микроокружение постоянно «общаются» и влияют друг на друга: микроокружение влияет на рост опухоли, а также само меняется на разных этапах ее развития. Меняется и состав клеток, и состав внеклеточного матрикса. Идеальная клеточная модель опухоли должна отражать все эти процессы. Сейчас при создании трехмерных клеточных культур исследователи чаще всего используют Matrigel – реагент, состоящий из белков внеклеточного матрикса и факторов роста, которые выделяют мышиные опухолевые клетки. Чтобы получить трехмерную культуру, в раствор матригеля, который полимеризуется при обычных для культивирования условиях, просто добавляют клетки опухоли. Они агрегируют, собираясь в небольшие комки, и затем делятся, образуя сфероиды, в которых клетки взаимодействуют и друг с другом, и с внеклеточным матриксом, – как в настоящей опухоли, только в миниатюре.
Несмотря на популярность, у матригеля есть несколько минусов. Во-первых, его получают из клеток мыши, поэтому он отличается от состава внеклеточного матрикса человека. Во-вторых, как ни удивительно, мы до сих пор не знаем его точный состав: хотя были работы, посвященные его детальной характеризации, из-за ограничений методов не удалось до конца установить, какие вещества и в каких количествах входят в матригель. Более того, состав матригеля может немного меняться от партии к партии.
Из-за этого ученые продолжают искать другие материалы, подходящие для создания трехмерных клеточных моделей. Было много попыток использовать гидрогели на основе гиалуроновой кислоты, хитозана, желатина или полиэтиленгликоля. Каркасы из них поддерживают структуру сфероида, но им не хватает биологической активности. Поэтому идет поиск такого материала, который максимально похож на естественный внеклеточный матрикс. Международный коллектив исследователей под руководством Альваро Маты (Alvaro Mata) решили использовать другой подход для решения этой проблемы.
Они приготовили гидрогель из двух компонентов. Первый компонент – раствор кератина или смесь растворов кератина и фибронектина. В нем нет ничего удивительного: эти белки есть во внеклеточном матриксе эпителиальных опухолей яичника. А вот второй компонент – амфифильные пептиды (АП) – оказался ключевым для успеха работы. Находясь в водном растворе, эти молекулы на основе пептидов могут самостоятельно собираться в похожие на структуру внеклеточного матрикса нановолокна (рис. 2), а также в другие формы – пузырьки, двойные слои, мицеллы, ленты, нанотрубочки (см. A. Dehsorkhi et al., 2014. Self‐assembling amphiphilic peptides). Свойства АП зависят от последовательностей аминокислот в их молекулах, поэтому можно синтезировать АП с разными свойствами.
Рис. 2. Химическая структура амфифильного пептида (АП). Амфифильные пептиды имеют гидрофобный углеводородный хвост (участок 1), и гидрофильный блок (участки 2–5). Гидрофильный блок молекулы состоит из аминокислот, которые подбираются в зависимости от требуемых свойств. В данном случае участок 2 состоит из четырех остатков цистеина и ответственен за полимеризацию. Участок 3 – гибкий линкерный участок из трех остатков глицина. Участок 4 – фосфорилированный остаток серина, который может взаимодействовать с ионами кальция, а участок 5 содержит последовательность RGD (аргинин – глицин – аспартат) со свойством клеточной адгезии. В середине изображена модель молекулы АП – она имеет конусообразную форму с узким гидрофобным хвостом и широким гидрофильным основанием. Черным показаны атомы углерода, белым – водорода, красным – кислорода, синим – азота, голубым – фосфора, желтым- серы. Внизу приведена схема самосборки молекул АП в цилиндрическую структуру. Иллюстрация из статьи J. D. Hartgerink et al., 2001. Self-Assembly and Mineralization of Peptide-Amphiphile Nanofibers.
Ранее лаборатория Маты уже создавала АП с улучшенными способностями к самосборке в нановолокна (которые были названы PA-H, см. C. L. Hedegart et al., 2018. Hydrodynamically guided hierarchical self-assembly of peptide-protein bioinks). В обсуждаемой работе эти способности еще больше усилили, добавив последовательность аминокислот из эластина – важного белка внеклеточного матрикса (полученные молекулы АП назвали PA-VH). Дополнительно авторы синтезировали два вспомогательных АП. Один из них (PA-RGDS) потенциально улучшает клеточную адгезию, а второй (PA-GHK) потенциально улучшает деление клеток и может способствовать прорастанию сосудов в опухоль. После дефисов в названиях пептидов указаны ключевые мотивы в гидрофильных участках (а PA – это просто сокращение от peptide amphiphile).
Гидрогель состоял из смеси растворов белков и PA-VH. На микроскопическом уровне он состоит из нановолокон, собранных из АП. Сперва ученые проверили, подходит ли этот гидрогель для выращивания трехмерных культур клеток. Оказалось, что подходит: он вполне выдерживал вес клеток, позволяя им собираться в объемные структуры, и был достаточно стабильным, чтобы поддерживать ее длительное время. При этом гидрогель не мешал клеткам секретировать внеклеточный матрикс.
Далее авторы заключили в гидрогель клетки эпителиальной опухоли яичника (они не объясняют, почему был сделан выбор именно в пользу этого типа рака; вероятно, одна из причин заключается в том, что рак яичника – один из самых распространенных типов рака у людей, он входит в первую десятку печального списка самых смертоносных онкологических заболеваний по числу ежегодных жертв). Клетки помещали в раствор кератина, затем добавляли раствор PA-VH. Гель с клетками полимеризовался, затем его помещали в ростовую среду. За формированием сфероидов, взаимодействием клеток между собой и с матриксом наблюдали в течение нескольких недель. Одновременно такой же эксперимент проводили с матригелем в качестве матрикса – для сравнения.
Клетки в новом гидрогеле росли медленней, чем в матригеле, хотя это скорее свойство матригеля – ускорять деление клеток в культурах (C. Fischbach et al., 2007. Engineering tumors with 3D scaffolds). Большим плюсом нового гидрогеля оказалась стабильность. Если в моделях на основе матригеля на третью неделю клетки выпадали из сфероида, а матрикс заметно разрушался, то в моделях из нового гидрогеля этого не наблюдалось. На 21-й день эксперимента сохранилось 100% сфероидов из гидрогеля, а из матригеля – только 60%.
Электронная микроскопия показала, что трехмерные культуры в новом гидрогеле более компактные, поверхность имеет обычную для эпителиальных клеток структуру. Кроме того, было видно, что клетки прикреплены к сети образованных гидрогелем нановолокон (рис. 3).
Рис. 3. Изображения сфероидов на основе гидрогеля из PA-VH и кератина, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа. Возраст сфероидов – 14 дней. На фото слева видно, что поверхность сфероида имеет структуру брусчатки, обычную для эпителиальных клеток. Справа видны места прикрепления клеток к матриксу из нановолокон гидрогеля. Изображение из обсуждаемой статьи в Science Advances.
Когда опухоль становится слишком большой, ее клеткам перестает хватать кислорода и они инициируют прорастание сосудов. Этот процесс запускают злокачественные клетки, выделяя вещества, направленные клеткам эндотелия, из которых состоит выстилка кровеносных сосудов. В культуре этот процесс можно сымитировать, получая сфероиды из опухолевых клеток и клеток эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Этот подход описан в статье G. Chiew et al., 2015. Physical supports from liver cancer cells are essential for differentiation and remodeling of endothelial cells in a HepG2-HUVEC co-culture model. Когда сфероид вырастает до достаточно крупных размеров, клетки HUVEC мигрируют внутрь него – туда, где мало кислорода.
Ученые протестировали, как ведут себя клетки HUVEC в исследуемом гидрогеле. В трехмерных моделях они вырастали, но не могли установить нормальное взаимодействие. Один из способов им помочь – добавить в гидрогель дополнительные белки внеклеточного матрикса. Другой способ – культивировать клетки вместе с мезенхимальными стволовыми клетками (см. F. Böhrnsen, H. Schliephake, 2016. Supportive angiogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells in monolayer and co-cultures). Эти клетки выделяют вещества, которые помогают эндотелиальным клеткам взаимодействовать между собой, и впоследствии способствуют прорастанию сосудов в опухоль. Поэтому исследователи объединили в одной клеточной модели клетки опухоли яичника, клетки HUVEC и мезенхимальные стволовые клетки человека. Осталось подобрать правильный состав гидрогеля. Помимо PA-VH в состав добавляли либо PA-RGDS, который улучшает клеточную адгезию, либо PA-GHK, который улучшает пролиферацию и потенциально может способствовать прорастанию сосудов в опухоль. В качестве белков использовали либо кератин, либо смесь кератина и фибронектина.
При взаимодействии клеток HUVEC образуются сети из внеклеточного F-актина, которые можно окрасить флюоресцентным красителем фаллоидином. В гидрогелях с добавками PA-GHK или PA-RGDS они образовывались лучше, чем в тех, которые состояли только из PA-VH. Добавление фибронектина не влияло на рост и взаимодействие клеток. Гидрогель с добавкой PA-GHK оказался более хрупким, поэтому для дальнейшего анализа использовали гидрогель с добавкой PA-RGDS. Клетки тройной культуры в таком гидрогеле вели себя так же, как в матригеле, – в этом смысле новый гидрогель не уступил своему конкуренту.
В экспериментальном гидрогеле сфероиды из трех типов клеток были плотнее сфероидов только из клеток опухоли яичника. Авторы предполагают, что присутствие эндотелия и мезенхимальных стволовых клеток привело к усилению клеточных взаимодействий. Авторы также наблюдали развитую сеть F-актина, в том числе и между сфероидами (рис. 4). Однако, пока нельзя сделать точных выводов, что она образуется из-за миграции клеток HUVEC внутрь сфероида и непонятно, насколько хорошо ли она отражает начало прорастания сосудов. Авторы предлагают проведение дополнительных исследований и хотели бы оптимизировать состав гидрогеля для них.
Рис. 4. Сфероиды из трех типов клеток на основе гидрогеля из PA-VH/PA-RGDS и кератина. Слева – иммунофлюоресцентное окрашивание сфероидов. Красным цветом обозначена сеть F-актина (окрашивание фаллоидином), зеленым – белок CD31 (маркер эндотелиальных клеток), синим – ядра клеток (окрашивание DAPI). Справа – трехмерная реконструкция взаимодействия клеток. Возраст сфероидов – 7 дней. Изображение из обсуждаемой статьи в Science Advances.
Трехмерные культуры опухолей особенно нужны разработчикам химиотерапии. Предлагаемый в обсуждаемой работе подход к их созданию может помочь более точно имитировать поведение химиотерапевтических препаратов при введении в организм. Поэтому авторы изучили, как на полученные ими модели опухоли яичника влияют препараты первой линии химиотерапии (паклитаксел и карбоплатин), а также ингибитор матриксных металлопротеиназ GM6001, который препятствует прорастанию сосудов в опухоль. Для этого чистые трехмерные культуры клеток опухоли яичника, а также тройные модели помещали в культуральную среду с химиотерапевтическими препаратами. В присутствии паклитаксела или карбоплатина сфероиды и монокультур, и тройных культур вырастали до гораздо меньших размеров по сравнению с необработанными клетками. Препарат GM6001 не влиял на монокультуры, но несколько снижал рост тройных культур, – вероятно потому, что воздействовал на внеклеточный матрикс. Интересно, что при добавлении химиотерапевтических агентов к трехмерным культурам на основе матригеля количество живых клеток снижалось заметно быстрее. Это еще один недостаток моделей на основе матригеля – лекарственные вещества слишком быстро проникают в матрикс. Поэтому результаты, полученные на новом гидрогеле, должны точнее отражать то, что происходит в реальной опухоли.
У нового гидрогеля есть еще одно важное преимущество перед другими каркасами для трехмерных культур: его можно настраивать под разные виды опухолей, добавляя необходимые компоненты, в том числе факторы роста. Так, внеклеточный матрикс опухолей мозга отличается от здоровых тканей мозга присутствием большого количества гиалуроновой кислоты и (или) коллагенов, а также другим содержанием протеогликанов хондроитинсульфатов (D. Sood et al., 2019. 3D extracellular matrix microenvironment in bioengineered tissue models of primary pediatric and adult brain tumors). В обсуждаемом исследовании авторы использовали кератин – белок, который содержится во внеклеточном матриксе эпителия яичника. Также можно менять состав и свойства амфифильных пептидов и получать наноструктуры матрикса, характерные для исследуемого органа. Кроме того, такие гидрогели можно использовать для биопринтинга и создания искусственных тканей и органов.
Екатерина Грачева, «Элементы»
Источник: Hedegaard et al., Peptide-protein coassembling matrices as a biomimetic 3D model of ovarian cancer // Science Advances. 2020.
Портал «Вечная молодость» vechnayamolodost.ru
